본 연구는 제주산 해조류의 생리활성을 대량검색하기 위해 HTS 기법을 이용한 실험과정의 제어 및 관리를 위한 자동화 시스템을 구축하고자 DPPH 라디칼을 이용하여 HTS를 이용한 자동화 시스템을 구축하고 제주산 해조류의 DPPH 라디칼 소거활성을 대량 검색하고자 하였다. 그 결과 HTS를 위한 효율적인 검색방법을 개발하였고 DPPH 라디칼 소거활성이 높은 해조류를 검색하게 되었다. 녹조류의 경우 납작파래 (20G6)의 $20^{\circ}C$ 추출물(1 mg/ml)에서 약 60%이 DPPH 라디칼 소거활성을 보였을 뿐 나머지 해조류에서는 40% 미만이 낮은 활성만을 보였다. 갈조류의 경우 꽈배기 모자반 (20B17), (70B17), 참그물바탕말 (70B1), 큰잎모자반 (70B16)과 감태 (70B26)에서 DPPH 라디칼 소거활성이 우수하였다. 홍조류 중에서는 왜떨기나무붉은실 (20R24)에서 가장 우수한 DPPH 라디칼 소거활성을 나타내었고 갈래잎 (20R17), 굵은참우뭇가사리 (20R18), 부채분홍잎 (20R23) 또한 높은 소거활성을 보였다. 따라서 우수한 효과를 나타내었던 해조류를 대상으로 용매분획 및 활성물질의 분리, 정제를 통해 해조류 유래의 기능성 신소재를 개발한다면, 해조류의 고부가가치화 및 HTS기술의 보편화에 큰 영향을 미칠 것으로 판단된다.
본 연구는 약용 버섯으로 쓰이는 구름버섯을 ethyl acetate, ethanol 및 methanol 등으로 추출하고 각 추출용매에 따른 구름버섯 추출물로부터 총 폴리페놀 및 총 플라보노이드 함량을 측정하였으며, DPPH 라디칼 소거능과 ABTS 라디칼소거능 등의 항산화 활성 및 항균 활성을 조사하였다. 구름버섯의 총 폴리페놀 함량과 총 플라보노이드 함량은 ethyl acetate와 ethanol 추출물에서 methanol 추출물보다 높게 나타났다. DPPH 라디칼 소거능은 methanol 추출물이 대조구로 사용한 1 mM ascorbic acid의 DPPH 라디칼 소거능과 유사한 약 80% 소거능을 보여주었으며, ethanol 추출물과 ethyl acetate 추출물보다 유의적으로 높았다. ABTS 라디칼 소거능은 모든 추출물에서 ascorbic acid의 활성과 유사한 약 90% 소거능이 측정되었다. 결과적으로 추출용매의 종류에 따라 DPPH 라디칼 소거능은 영향을 받지만, ABTS 라디칼은 극성 및 비극성 물질 모두와 반응하여 소거되므로 추출용매의 영향 없이 높은 ABTS 라디칼 소거능을 나타내었다. 그리고 구름버섯의 항균 활성 측정 결과 모든 추출물에서 S. aureus를 제외한 모든 균주에 대한 활성을 확인할 수 있었으며, 다양한 다제내성 균주에 대한 구름버섯의 항균활성은 구름버섯이 천연 항균 소재로서의 가능성이 있음을 보여주는 의미 있는 결과이다. 또한 DPPH 라디칼과 ABTS 라디칼 소거능이 ascorbic acid와 같이 높은 항산화능을 보임으로써 구름버섯이 천연 항산화제로서 이용 가치가 있음을 확인할 수 있었다. 이렇게 항균 및 항산화 활성을 동시에 나타내는 구름버섯은 향후 분야별 허용 추출용매를 이용하여 추출방법 및 추출조건 등을 일부 변형한다면 건강기능성 식품 및 화장품 등에 첨가 가능한 원료소재로 활용될 수 있을 것으로 생각된다.
삼백초 지상부의 에탄올 추출농도와 추출 시간에 따른 수율, total phenol과 total flavonoid함량, DPPH 라디칼 소거능을 조사하였다. 추출 온도 9$0^{\circ}C$에서 에탄올농도를 증가시키면서 8시간동안 환류추출하였다. 추출수율과 DPPH 라디칼 소거능은 에탄올농도 40%까지는 증가하다가 60%이상에서는 감소하였고 total phenolic compound와 total flavonoid의 함량도 비슷한 경향을 보였다. total phenolic compound의 함량은 40%와 60%에서 큰 차이가 없는 반면 total flavonoid의 함량은 40%에서 더 높았다. total phenolic compound와 total flavonoid 함량, DPPH 라디칼 소거능 및 추출수율은 40% 이상에서는 큰 변화가 없어 추출용매의 조건은 40% 에탄올로 선정하였다. 40% 에탄올로 9$0^{\circ}C$에서 24시간 동안 4시간 간격으로 환류추출하였을 때 total phenolic compound와 total flavonoid 함량, DPPH 라디칼 소거능 및 추출수율은 4시간 이후 큰 차이가 없었다. 삼백초의 용매추출조건으로는 40% 에탄올, 4시간 추출하는 것이 적합하다고 판정된다.
천연물로부터 항산화 활성물질을 목적으로 DPPH 자유 라디칼 소거활성 검색법을 이용하여 검색을 실사하고, 유의한 활성을 나타낸 산국 메탄올 추출물로부터 2종의 화합물을 분리하고 기기분석을 이용하여 화합물 1과 2의 구조를 apigenin과 acacetin-7-O-rutinoside (Linarin)으로 동정하였다. 이들 화합물은 각각 13.3 및 $42.1{\mu}g$의 농도에서 DPPH 라디칼을 50% 소거하는 활성을 나타내었으며, 화합물 1은 양성 대조양물인 L-ascorbic acid $(RC_{50}\;=\;13.1{\mu}g)$에 비하여 강한 활성을 나타내었다.
우리나라에서 소비량인 높은 대표적인 해조류인 김, 미역, 다시마 및 톳을 이용하여 추출물을 제조하여 추출물의 추출수율, 색도, 총 페놀 함량, DPPH 라디칼 소거능 및 ABTS 라디칼 소거능을 분석하였고, 추출물의 지질산화 억제능 및 tyrosinase 억제활성을 분석하였다. 용매를 이용하여 김, 미역 다시마 및 톳의 추출물 수율은 3.00, 5.38, 11.73 및 0.72%를 나타내었고, 색도 분석 결과 김, 미역, 다시마 및 톳 추출물의 명도는 82.88, 78.53, 83.04 및 78.11로 다시마 추출물의 명도가 가장 밝은 것으로 나타났으나 김 추출물의 명도와 유의적 차이는 나타나지 않았다. 총 페놀 함량은 김, 미역, 다시마 및 톳 추출물이 각각 42.23, 11.59, 10.09 및 46.59 mg/g으로 나타냈다. DPPH 라디칼의 경우 톳 추출물이 82.43%로 가장 높은 라디칼 소거능을 나타냈으며 김 추출물의 경우 26.76%의 라디칼 소거능을 확인하였다. ABTS 라디칼 소거능의 경우 DPPH 라디칼 소거능 결과와 유사한 경향을 나타내었다. 또한 해조류 추출물의 tyrosinase inhibition effect 결과는 김, 미역, 다시마 및 톳 추출물의 tyrosinase inhibition이 각각 25.93, 26.32, 24.76 및 20.24%의 활성을 나타냈으며 유의적인 차이는 나타내지 않는 것으로 확인하였다. 해조류 추출물의 총 페놀화합물, DPPH 라디칼 소거능, ABTS 라디칼 소거능 및 미백활성에 대한 상관분석 결과 해조류 추출물의 총 페놀 함량은 DPPH 및 ABTS 라디칼 소거능의 결과 값과 P<0.001 수준에서 유의적으로 상관관계를 나타내는 것으로 확인되었다.
본 연구에서는 전통적으로 약으로써 이용되었거나 민간요법으로 사용되던 식물을 문헌고찰을 통해 40여종(자생식물 26종과 생약식물 14종)을 선발하여, 폴리페놀과 플라보노이드 함량 측정 및 DPPH 라디칼 소거능을 측정하였다. 자생식물인 비수리의 폴리페놀(228.90 mg/g extract)과 플라보노이드 함량(90.15 mg/g extract)이 가장 높았으며, DPPH 라디칼 소거능(75.69%)이 모두 높게 나타났다. 감나무와 관중의 폴리페놀 함량(감나무 112.98 mg/g extract, 관중 121.46 mg/g extract)과 플라보노이드 함량(감나무 46.10 mg/g extract, 관중 58.69 mg/g extract)은 높은 편은 아니었으나, DPPH라디칼 소거능은 각각 72.87%와 79.50%로 가장 높게 나타났다. 생약식물에서는 삼백초의 총 폴리페놀함량이 194.60 mg/g extract, 애엽이 203.93 mg/g extract로 폴리페놀 함량이 높았으며, DPPH 라디칼 소거능(삼백초 66.27%, 애엽 66.22%) 또한 높게 나타났다. 그러나 삼백초와 애엽을 제외한 12종류의 생약식물의 DPPH 라디칼 소거능이 50% 미만인 것으로 조사되었다. 최근에 다양한 자생식물과 약용식물의 폴리페놀, 플라보노이드 함량 및 기능성 탐색에 대한 연구가 많이 진행되고 있지만, 아직까지도 연구되지 않은 무수히 많은 식물 소재들이 많아서 지속적인 연구가 필요하다. 본 연구 결과, 그 동안 대중화 되어있지 않았던 식물 소재들의 기능성 소재로의 가능성이 새롭게 조명 될 수 있을 것으로 사료되며 이와 관련된 의약품, 미용제품 및 건강보조식품 등의 개발에 기초자료로 이용될 수 있을 것으로 기대된다. 향후 본 연구에서 조사한 자생식물과 생약식물 중 총 폴리페놀함량과 플라보노이드 함량이 높고, DPPH 라디칼 소거능이 뛰어나게 나타난 몇몇 식물에 대한 심도 있는 연구가 필요할 것으로 판단된다.
민들레의 부위별 항산화활성을 검토하기 위하여 지상부 및 지하부의 물, 50, 70, 100% 에탄올 용액과 열수추출조건을 이용하여 얻은 추출물의 DPPH 및 ABTS 라디칼 소거능을 분석하였다. 민들레 지상부 및 지하부 열수추출물의 DPPH 라디칼 소거능이 가장 우수한 것으로 분석되었으며, 추출물의 DPPH 라디칼 소거력은 열수추출물 > 70% 에탄올 추출물 > 50% 에탄올 추출물 > 100% 에탄올 추출물 > 물 추출물 순으로 나타났다. 추출물의 ABTS 라디칼 소거활성을 검토한 결과 지상부 및 지하부의 추출물중 열수추출물이 가장 높은 ABTS 라디칼 소거능을 나타낸 반면 물추출물은 가장 낮은 소거능을 나타내어 DPPH 라디칼 소거능을 분석한 결과와 유사한 경향을 나타내었다. 또한 항산화활성이 가장 우수한 것으로 나타난 열수추출물을 이용하여 극성별 유기용매(클로로포름, 에틸아세테이트, 부탄올)을 이용한 분획물을 얻어 이들의 항산화활성을 검토하였다. ABTS 및 DPPH 라디칼 소거활성, 총 페놀성화합물의 함량을 분석한 결과 에틸아세테이트 분획물의 항산화 활성이 가장 우수한 것으로 나타났으며, 에틸아세테이트 분획물을 제외한 클로로포름, 부탄올, 물 분획물의 경우 지상부 분획물이 지하부보다 라디칼 소거능이 우수한 것으로 나타났다. 각 분획물들이 RAW 264.7 대식세포주에서 LPS 처리에 의한 nitric oxide 생성에 미치는 영향을 검토하였다. 지상부 및 지하부의 에틸아세테이트 분획물이 LPS 처리에 의해 증가한 nitric oxide의 생성을 효과적으로 억제하였으며, 지상부 에틸아세테이트 분획물 $20{\mu}g/mL$ 처리시 LPS 처리에 의해 증가된 NO 생성을 약 50% 저해하는 것으로 나타났으며, 이러한 효과는 지하부 에틸아세테이트 분획물보다 우수한 것으로 분석되었다. 본 연구는 민들레 부위별 다양한 추출조건에서 획득한 추출물들의 총 항산화활성을 비교분석하여 제시함으로써 소재개발을 위한 추출조건을 설정하는데 활용될 수 있을 것으로 판단되며, 또한 각 분획물들의 총 항산화활성 및 RAW 264.7 대식세포주를 이용하여 LPS 처리에 의해 증가된 nitric oxide의 생성억제능을 비교분석하여 제시함으로써 기능성 소재개발에 있어서 기초자료로 활용 할 수 있을 것으로 판단된다.
민들레 잎의 열수 추출물의 항산화 활성 증진을 위한 추출조건을 최적화하기 위하여 반응표면분석법을 사용하였다. 중심합성 계획에 따라 추출조건의 독립변수(추출온도, 용매비, 추출시간)와 이에 따라 영향을 받는 종속변수(수율, 총 폴리페놀 함량, 총 플라보노이드 함량, DPPH 라디칼 소거활성, ABTS 라디칼 소거활성, superoxide 라디칼 소거활성)를 설정하였다. 추출물의 수율은 추출시간에 의해 거의 영향을 받지 않는 것으로 나타났으며 시료의 용매비가 증가할수록 감소하였고, $70^{\circ}C$ 이상의 추출온도에서 감소하는 것으로 나타났다. 총 폴리페놀과 총 플라보노이드 함량은 추출온도가 증가함에 따라 크게 증가하였으며, DPPH 라디칼, ABTS 라디칼, superoxide 라디칼 소거활성도 추출온도에 가장 크게 영향을 받아 추출온도가 증가함에 따라 증가하다가 최적온도 이후에 약간 감소하는 것으로 나타났다. 이들 추출물의 특성을 모두 만족시키는 최적 추출조건은 추출 온도 83.77$\pm$1.07$^{\circ}C$, 시료에 대한 용매비 20.85$\pm$0.24 mL/g, 추출시간 1.59$\pm$0.12 hr이었고 이 때 예측된 수율은 38.98%, 총 폴리페놀 함량은 74.28 ${\mu}g$/mg, 총 플라보노이드 함량은 74.00 ${\mu}g$/mg이었으며, DPPH 라디칼, ABTS 라디칼, superoxide 라디칼의 소거활성($IC_{50}$)의 예측 특성값은 각각 0.14 mg/mL, 3.24 mg/mL, 2.49 mg/mL로 나타났다.
삼나물 뿌리를 80% 메탄올로 침지 추출하여 얻어진 추출물에 대해 n-hexane, EtOAc 및 n-BuOH의 유기용매를 활용하여 순차 분획을 실시하였고, 얻어진 결과물에 대하여 DPPH, $ABTS^+$ 라디칼 소거능 및 ${\alpha}$-glucosidase 저해활성을 평가하였다. DPPH 라디칼 소거능은 총 페놀성 화합물의 함량이 상대적으로 높은 EtOAc 층에서 $IC_{50}$값이 $32.3{\pm}2.3{\mu}g/mL$으로 가장 우수한 DPPH 라디칼 소거능을 확인하였고, 삼나물 뿌리 의 EtOAc 가용부에 다량 존재하는 페놀성 화합물과 라디칼 소거능과의 연관성을 시사하였다. 또한 $ABTS^+$ 라디칼 소거능은 EtOAc 층의 $IC_{50}$값이 $18.9{\pm}2.1{\mu}g/mL$의 우수한 라디칼 소거활성이 확인 하였고, 우수한 라디칼 소거 활성물질의 존재가 시사되었다. 또한, ${\alpha}$-glucosidase 저해활성을 평가한 결과, 우수한 라디칼 소거능을 나타낸 EtOAc 층의 $IC_{50}$은 $57.8{\pm}7.8{\mu}g/mL$의 저해활성을 나타내었으며, 이는 positive control인 acarbose의 $IC_{50}$값인 $501.1{\pm}17.5{\mu}g/mL$과 비교하여 우수한 활성이었으며, 추출물 상태의 시료를 단일물질로 정제할 경우 더욱 강한 효능의 화합물이 존재할 가능성을 시사하였다. 향후 이들 활성물질 동정을 통한 활성 기작에 대한 연구가 필요하며 본 연구결과는 보다 우수한 라디칼 소거능 및 ${\alpha}$-glucosidase 저해능을 가지는 새로운 기능성 소재 발굴을 위한 기초자료로 활용 가능할 것으로 사료된다.
본 연구에서는 1.1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH), hydroxyl radical ($^{\cdot}OH$), 그리고 superoxide radical ($O_2{^-}$) 소거능 실험을 통해 쑥부쟁이의 항산화 효과를 평가하였다. 쑥부쟁이는 에탄올로 추출한 뒤, n-hexane, methylene chloride ($CH_2Cl_2$), ethylacetate (EtOAc), 그리고 n-butanol (n-BuOH)로 분획하였다. DPPH 라디칼 소거능 실험에서 모든 추출 및 분획물이 $10-100{\mu}g/mL$의 농도에서 농도 의존적으로 라디칼 소거능이 증가하였으며, 특히 EtOAc 분획물은 가장 강한 DPPH 라디칼 소거능을 나타내었다. 또한 쑥부쟁이는 $50{\mu}g/mL$ 농도에서 80% 이상의 $^{\cdot}OH$ 라디칼 소거율을 보였다. 특히 EtOAc 분획물은 $0.03{\mu}g/mL$에서 IC50 값을 나타내어 추출물과 분획물 중 가장 강한 $^{\cdot}OH$ 라디칼 소거능을 보여주었다. 또한, EtOAc 분획물은 $O_2{^-}$ 라디칼 소거능에서도 가장 강한 소거활성을 보였다. 이러한 결과는 쑥부쟁이가 산화스트레스로 인한 질병을 예방하는 천연 항산화제로서의 활용 가능성이 있음을 보여준다.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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