• 원예과학기술지
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• 제33권6호
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• pp.947-954
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• 2015

질전환에 적합한 국화 스프레이 타입 품종을 선발하기 위해서 국내 연구기관에서 육성된 39개 품종 및 일본품종인 스탠다드 타입 신마를 모아 재분화율과 아그로박테리움 감염도를 조사하였다. 잎과 마디 절편체로부터의 신초 재분화를 위하여 IAA $0.5mg{\cdot}L^{-1}$와 BAP $1.0mg{\cdot}L^{-1}$가 첨가된 MS 배지를 사용하였다. 잎 절편체로부터의 신초 재분화는 BRM 품종이 가장 높았고 VS, WW, YTM 품종순으로 분화되었다. 이전에 형질전환재료로 보고된 바 있는 신마는 PK, SPP 품종과 유사한 수준을 보였다. 마디 절편체로부터의 신초 재분화는 PA 품종에서 가장 높았으며 WW 품종이 다음으로 확인되었다. 40개의 국화 품종을 대상으로 아그로박테리움에 대한 감염도를 조사한 결과, 잎 절편체에서는 WPP, YNW, VS, PP, WW, FA, PA, YMN 품종이 가장 높았고 마디 절편체에서는 WPP, PA, PK, YNW 품종이 가장 높았다. 이상의 결과를 종합해 볼 때 국화의 잎 절편체를 이용한 형질전환은 VS와 WW 품종이 가장 적합한 반면에 마디형질전환에는 PA 품종이 가장 적합한 것으로 확인되었다.

• Current Research on Agriculture and Life Sciences
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• 제32권4호
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• pp.175-177
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• 2014

This is the first report describing the seasonal conditions affecting shoot regeneration by the chrysanthemum cv. Baeksun. The shoot regeneration from petal explants was found to be more favorable from September to December, reaching the highest values in December. In addition, the quality of the shoots was also influenced according to the season of the explant collection, where healthy and uniform plants were derived from the explants collected in December. Choosing the proper season for explant collection affected the successive plant growth parameters (i.e., plant height and fresh weight). Thus, the current results strongly suggest that season plays an important role in plant tissue culturing, which is an essential tool for micropropagation and Agro-bacterium-mediated genetic transformation studies.

• Journal of Plant Biotechnology
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• 제6권1호
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• pp.25-37
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• 2004

Successful genetic transformation of plants requires non-chimeric selection of transformed tissues and their subsequent regeneration. With rare exceptions, most transformation protocols still rely heavily on antibiotics for selecting transgenic cells that contain an antibiotic-degrading selectable marker gene. Here, the morphogenic capacity of in-vitro explants of chrysanthemnum and tobacco stems and leaves (control and transgenic) changed with the addition of aminoglycoside antibiotics (AAs), In a test of 6 AAs, phytotoxicity occurred at concentrations of 10 to 25 and 50 to 100$\mu\textrm{g}$ $mL^{-1}$ in chrysanthemum and tobacco explants, respectively. Light conditions as well as explant source and size also had significant effects. The use of transverse thin cell layers (tTCLs), in conjunction with high initial AA selection levels, supported the greatest regeneration of transgenic material (adventitious shoots or callus) and the lowest number of escapes. Flow-cytometric analyses revealed no endodu-plication in chrysanthemum, even at high AA levels. However, this phenomenon was observed in tobacco calli(8C or more), even at low AA concentrations (i.e., 5 to 10 $\mu\textrm{g}$ mL$^{-1}$ ).

• Journal of Plant Biotechnology
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• 제36권4호
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• pp.366-372
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• 2009

This study was conducted to develop new lines expressing the characteristic of early flowering by introducing MdMADS2 gene in chrysanthemum (Dendranthema grandiflorum (Ramat.) Kitamura) ‘Zinba'. Transformation of chrysanthemum was conducted by Agrobacterium tumefaciens LBA4404 harboring the binary vector containing MdMADS2 controlled by double CaMV 35S promoters. Ninety three shoots were regenerated from 1,463 leaf segment explants cultured on the first selection medium (MS basal salts + 1.0 mg/L BA + 0.5 mg/L IAA + 10 mg/L kanamycin + 400 mg/L cefotaxime, pH 5.8) after co-cultivation, and 20 out of the 93 shoots rooted on the second selection medium containing 20 mg/L kanamycin and 400 mg/L cefotaxime. Many escapes (98.6%) were removed on the selection stage for rooting. Nineteen lines were confirmed as transgenic plant with transgene by PCR analysis. Six transgenic plants flowered 2-11 days earlier than non-transgenic plant without big change of phenotype, and especially, 3 (Mo-7, Mo-11, Mo-17) out of 6 transgenic lines showed a significant reduction in days to flowering compared to non-transgenic plant. Introduction and expression of MdMADS2 gene in them were confirmed by Southern and real-time PCR analyses, respectively.

• Journal of Plant Biotechnology
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• 제36권4호
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• pp.373-383
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• 2009

To set efficient transformation system in chrysanthemum, thirty-four chrysanthemum (Dendranthema grandiflorum Kitamura) varieties were collected and cultured for shoot regeneration. Five varieties, ‘Shuho-no-chikara', ‘Zinba', ‘Baekma', ‘Pink pride' and ‘Keumsu' of them were selected, because they had a high shoot regeneration efficiency. MS medium containing 1.0 mg/L NAA and BA respectively was very adequate for shoot regeneration in those varieties. MS medium with 3.0 mg/L NAA and 1.0 mg/L kinetin in ‘Shuho-no-chikara' and the medium with 0.5 mg/L NAA and 3.0 mg/L BA in ‘Keumsu' were also suitable for shoot regeneration. The most efficient callus induction and shoot regeneration were obtained on MS medium. Shoot regeneration was enhanced more than 8% on MS medium with 0.3% phytagel and 10-15 mg/L putrescine. The best cultural material for shoot regeneration was stem. When stem was used as a culture material, shoot regeneration rate was increased more than 26% and the days to shoot regeneration was shortened about 14 days.

• Journal of Plant Biotechnology
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• 제33권1호
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• pp.19-25
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• 2006

저온저항성 BN115 gene과 표지유전자로서 kanamycin에 저항성 있는 nptII gene을 가지고 있는 식물발현용 binary vector pBin19/BNl15가 도입된 A. tumefacience MP90을 국화잎과 공동배양 하였다. 또한 particle bombardment를 이용하여 목적으로 하는 유전자가 식물체에 안정적으로 도입되어 발현됨을 PCR 및 Real-Time PCR 검정으로 확인하였다. 국화잎과 공동배양에 사용된 Agrobacterium은 $5.0{\times}1.0{\mu}m$로 non-sporing, motile, rod 형이며, Callus는 pin이나 cork-borer에 의해 상처 난 잎 가장자리로부터 형성되어 식물체가 재분화 되었다. 유전자 도입조건은 Agrobacterium을$O.D._{600}{\approx}0.5$에서 20분간 공동배양 할 때, Particle bombardment는 helium 압력을 1,100 psi, target 거리를 9 cm로 유지했을 때, 가장 효율이 높았다. 5mg/L kanamycin이 들어 있는 배지에서 선발된 형질전환체는 PCR 분석으로 형질전환여부를 판별할 수 있었으며, 선발 10개체 중 9개체에서 purified pBN115와 같은 크기의 밴드가 형성되었다. Taq-Man probe를 이용한 Real-Time PCR 결과 $45{\sim}0.00045ng/{\mu}{\ell}$ 범위에서 pBN115 gene을 10배씩 serial dilution한 amplification plot는 일정한 간격으로 standard curve를 보였으며, slope는 -3.313975, R2는 0.998319이었다. Amplification plots의 형질전환체 $C_T$값은 $20.75{\sim}33.81$범위였으며, 유전자 copy수는 정량분석을 기초로 산출하였다. pBN115의 plasmid DNA를 serial dilution했을 때, standard는 $5.6{\times}10^{10}/45ng{\sim} 5.6{\times}10^5/0.00045ng\;copies/{\mu}{\ell}$이 었으며, 형질전환체는 $3.86{\times}10^8{\sim}12565.71 copies/{\mu}{\ell}$이었다. 따라서 PCR, Real-Time PCR 분석 결과 저온저항성 유전자가 국화의 genome에 안정적으로 도입되었음이 확인되었다.

• Journal of Plant Biotechnology
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• 제35권2호
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• pp.147-153
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• 2008

국화에 담배거세미 나방 (tobacco cutworm; Spodoptera litura)에 저항성을 나타내 국화를 육성하기 위하여 cry1Ac 유전자를 형질전환하였다. Cry1Ac 유전자는 pCAMBIA2301를 포함하는 Agrobacterium C58C1을 통하여 국화 'Linneker salmon'에 도입하였다. Agrobacterium C58C1을 접종한 후 엽절편을 10 mg/L kanamycin이 함유된 재분화 배지 (MS + 1.0 mg/L BA + 0.5 mg/L IAA)에서 1차 선발을 하였고, 재분화 배지에 20 mg/L kanamycin이 첨가된 배지에서 2차 선발을 하였으며, 20 mg/L kanamycin이 첨가된 MS 배지에서 3차 발근선발을 하였다. 3차 발근선발까지 69개의 신초 (1.6%)가 생존하여 발근하였다. NptII primer로 PCR을 한 결과 그 중 36개의 신초 (0.8%)가 putative transformant로 확인되었고, Southern 분석을 한 결과, 35개체 (0.8%)가 nptII 유전자와 cry1Ac 유전자를 가진 형질전환체로 확인되었다. Cry1Ac 유전자의 형질전환율은 0.8%로 양호하였다. 온실에서 담배거세미 나방에 대한 저항성을 검정한 결과, 3개체의 형질전환체가 저항성을 나타내는 것으로 확인되었다.

• Journal of Plant Biotechnology
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• 제35권1호
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• pp.55-61
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• 2008

PCR 및 Real-Time PCR 검정으로 확인된 국화 형질전환체는 저온저항성 BN115 gene과 표지유전자로 kanamycin에 저항성 있는 nptII gene을 가지고 있는 식물발현용 binary vector pBin19/BN115가 삽입된 A. tumefacience MP90을 국화잎에 공동 배양함으로 유전자가 도입되었다. 최종 선발된 형질전환체의 온도별 생육은 형질전환체가 비형질전환체에 비해 초장, 생체중, 엽수 모두 우수하였다. 또한 저온에서의 상해정도 관찰에서도 수침상정도가 비형질전환체보다 경미하였다. 저온의 외부환경에 따른 국화잎의 기공모양은 닫고 있는 비형질전환체와 달리 형질전환체는 개구된 모양을 유지하고 있었으며, 크기는 형질전환체의 크기가 비형질전환체보다 더 큰 것으로 측정되었다. 저온조건에서의 형질전환체 엽록소 함량은 5, $25^{\circ}C$에서는 비형질전환체와 비교하여 SPAD value 값에 큰 차이가 없었지만, 10, $15^{\circ}C$에서는 최대 +5.7 (평균+3.0), +9.7 (평균 +5.7)로 상대적으로 높은 함량을 나타냈다 또한 Ion leakage test결과 저온저항성 유전자가 도입된 형질전환체의 세포가 외부환경에 안정적으로 적응하여 세포내 파괴나 상해를 받지 않음으로 형질전환체의 EC 농도 (ds/m)가 비형질전환체에 비해 $1.29{\sim}1.97$배 낮은 수치를 보였다.

• 한국식물생명공학회:학술대회논문집
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• 한국식물생명공학회 2005년도 추계학술대회 및 한일 식물생명공학 심포지엄
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• pp.254-254
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• 2005

• 원예과학기술지
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• 제28권3호
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• pp.449-455
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• 2010

본 연구는 경남 화훼연구소에서 개발 육성된 스프레이형 국화 18 품종들에 대한 재분화율을 각각 조사하고, 그 중에서 '무랑루즈'가 가장 우수한 재분화 능력이 있음을 확인하였다. 특히 BA($0.5mg{\cdot}L^{-1}$)와 NAA($1.0mg{\cdot}L^{-1}$)를 함유한 MS배지를 신초재분화 배지로 이용함으로써 스탠다드형 국화인 신마와 함께 스프레이형 국화인 '무랑루즈'의 잎 절편체부터 효율적으로 신초 형성을 유도하고 완전한 식물체로 재분화시킬 수 있었다. 이러한 신초재분화 조건에서 '무랑루즈'잎 절편에 아그로박테리움을 감염하고 10일 동안 함께 배양한 후에, 선발항생제 kanamycin 농도를 저농도($10mg{\cdot}L^{-1}$)에서 고농도($30mg{\cdot}L^{-1}$)로 단계적으로 선발과정을 강화함으로써 효율적인 국화 형질전환체 제작이 가능하였다. 조사한 kanamycin 저항성 식물체 모두에서 전이유전자 $AtSICKLE$가 존재함을 genomic PCR 방법으로 확인하였다. 비록, 국화에서 그 기능이 비효율적인 CaMV 35S 프로모터를 사용했기 때문에 RT-PCR로 확인한 형질전환체에서의 전이유전자 $AtSICKLE$의 발현율은 상대적으로 낮았으나, 그 발현이 상대적으로 높은 개체에선 잎의 상편생장에 의한 엽형의 변화가 나타났다. 이러한 연구의 결과는 모델 식물체에서 분리되고 연구된 많은 유전자들이 가지는 화훼작물의 분자육종학적 가치를 국화에서 대량으로 조사할 수 있는 기반을 제공 할 것으로 기대된다.