• Journal of Microbiology and Biotechnology
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• 제20권2호
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• pp.325-331
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• 2010

Rhodococcus erythropolis amidase was expressed in Escherichia coli cells. The crude amidase in the cell-free extract was immobilized using the cross-linked enzyme aggregate (CLEA) method. The crude amidase was mixed with bovine serum albumin and then precipitated with ammonium sulfate. The resultant precipitant was subsequently cross-linked with glutaraldehyde. Scanning electron microscopy revealed that this co-CLEA had a ball-like shape with a diameter of approximately $1\;{\mu}m$. This co-CLEA evidenced hydrolytic activity toward a variety of amide substrates. The amidase co-CLEA evidenced an optimum temperature of $60^{\circ}C$ and an optimum pH of 8.0, results that were similar to those of the soluble amidase. The reaction stability of the co-CLEA was increased. That is, it was stable up to $50^{\circ}C$ and in a pH range of 5.0-12.0. Additionally, the co-CLEA could be recovered by centrifugation, and retained 96% activity after 3 repeated cycles. This amidase co-CLEA may prove useful as a substitute for soluble amidase as a biocatalyst in the pharmaceutical and chemical industries.

• Journal of Microbiology and Biotechnology
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• 제27권2호
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• pp.289-296
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• 2017

Lysine decarboxylase (CadA) converts ${\small{L}}-lysine$ into cadaverine (1,5-pentanediamine), which is an important platform chemical with many industrial applications. Although there have been many efforts to produce cadaverine through the soluble CadA enzyme or Escherichia coli whole cells overexpressing the CadA enzyme, there have been few reports concerning the immobilization of the CadA enzyme. Here, we have prepared a cross-linked enzyme aggregate (CLEA) of E. coli CadA and performed bioconversion using $CadA^{CLEA}$. $CadA^{free}$ and $CadA^{CLEA}$ were characterized for their enzymatic properties. The optimum temperatures of $CadA^{free}$ and $CadA^{CLEA}$ were $60^{\circ}C$ and $55^{\circ}C$, respectively. The thermostability of $CadA^{CLEA}$ was significantly higher than that of $CadA^{free}$. The optimum pH of both enzymes was 6.0. $CadA^{free}$ could not be recovered after use, whereas $CadA^{CLEA}$ was rapidly recovered and the residual activity was 53% after the $10^{th}$ recycle. These results demonstrate that $CadA^{CLEA}$ can be used as a potential catalyst for efficient production of cadaverine.

• Journal of Microbiology and Biotechnology
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• 제21권11호
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• pp.1159-1165
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• 2011

Biodiesel is methyl and ethyl esters of long-chain fatty acids produced from vegetable oils or animal fats. Lipase enzymes have occasionally been used for the production of this biofuel. Recently, biodiesel production using immobilized lipase has received increased attention. Through enhanced stability and reusability, immobilized lipase can contribute to the reduction of the costs inherent to biodiesel production. In this study, methanol-tolerant lipase M37 from Photobacterium lipolyticum was immobilized using the cross-linked enzyme aggregate (CLEA) method. Lipase M37 has a high lysine content (9.7%) in its protein sequence. Most lysine residues are located evenly over the surface of the protein, except for the lid structure region, which makes the CLEA preparation yield quite high (~93%). CLEA M37 evidences an optimal temperature of $30^{\circ}C$, and an optimal pH of 9-10. It was stable up to $50^{\circ}C$ and in a pH range of 4.0-11.0. Both soluble M37 and CLEA M37 were stable in the presence of high concentrations of methanol, ethanol, 1-propanol, and n-butanol. That is, their activities were maintained at solvent concentrations above 10% (v/v). CLEA M37 could produce biodiesel from olive oil and alcohols such as methanol and ethanol. Additionally, CLEA M37 generated biodiesel via both 2-step methanol feeding procedures. Considering its physical stability and reusability, CLEA M37 may potentially be used as a catalyst in organic synthesis, including the biodiesel production reaction.

• 한국식품영양과학회지
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• 제39권2호
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• pp.193-202
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• 2010

더덕 70% 에탄올 추출물(CL) 및 그 분획물들(헥산, 클로로포름, 에틸아세테이트, 부탄올 그리고 물)의 in vitro 항산화 효과는 총 페놀 함량, 환원력, ABTS, DPPH 및 ORAC 분석법들로 실험하였다. 더덕 70% 에탄올 추출물의 에틸아세테이트 분획물(CLEA)은 가장 높은 총 페놀 함량을 보여 주었고 그 함량은 22.7 mg/g이었으며, CLEA는 $250\sim1,000\;{\mu}g/mL$에서 0.42~1.27로 뛰어난 환원력을 가지고 있었다. $100\sim400\;{\mu}g/mL$에서 CLEA는 27.7~70.3의 ABTS radical 소거작용을 보여주었으며, $400\;{\mu}g/mL$에서 81.6%로 가장 높은 DPPH radical 소거활성을 나타내었다. CLEA는 가장 높은 $ORAC_{{ROO}{\cdot}}$ 활성을 가졌고, CLEA와 부탄올 분획물은 70% 에탄올, 헥산, 클로로포롬 그리고 물 분획물보다 현저하게 높은 $ORAC_{{ROO}{\cdot}}$ 활성을 나타내었다. CLEA는 CL 70% 에탄올 추출물과 그 분획물들 중 가장 높은 항산화효과를 가지고 있었다. 따라서 고지방식이에 의해 산화적 스트레스가 유발된 동물 모델에 CLEA를 섭취시켰을 때 항산화 유전자 발현 변화를 microarray와 RT-PCR 기법으로 알아보았다. 31개의 항산화 유전자가 발현되었으나 CLEA 섭취에 의해 2배 이상 발현 증가를 보인 항산화 유전자는 없었다. 결론적으로 CLEA는 직접적인 항산화 효과는 있으나 고지방식 이에 의해 유도된 비만 마우스 내에서 항산화 유전자 발현 증가에 의한 간접적인 항산화 효과는 없었다.

• 한국식품과학회지
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• 제40권6호
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• pp.696-701
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• 2008

이 연구의 목적은 더덕 및 도라지 에틸아세테이트 분획물(CLEA나 PGEA)이 다양한 항산화 시스템을 가동시켜 sodium nitroprusside(SNP)에 의해 유도된 산화적 스트레스에 대항하여 세포를 보호해 줄 수 있을지 연구하는 것이다. 0.5 mM의 SNP를 HepG2 세포주에 24시간 동안 노출시켰을 때 세포 생존율이 감소하였으나, CLEA와 PGEA 천처리에 의해 SNP 노출에 의한 세포 생존율 감소가 저해되었다. 또한 항산화 시스템들 발현에 미치는 CLEA와 PGEA의 영향을 RT-PCR로 알아보았다. Catalase, glucose-6-phosphate dehydrogenase(G6PD) 그리고 metallothionein (MT)-1A mRNA 수준이 CLEA를 세포에 24시간 동안 처리한 후 증가하였고, Mn superoxide dismutase, catalase, G6PD, MT-1A 와 MT-2A mRNA 수준이 PGEA 처리에 의해 증가하였다. 우리는 CLEA와 PGEA가 아마 다양한 항산화 시스템들을 증가시키는 간접적인 항산화 효과를 나타내며, 이들 효과들이 산화적 스트레스로부터 세포를 보호해 줄 것이라 추정하였다.

• 한국산학기술학회:학술대회논문집
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• 한국산학기술학회 2010년도 추계학술발표논문집 1부
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• pp.495-499
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• 2010

The biocatalytic capture of $CO_2$, and its precipitationas $CaCO_3$, over bovine carbonic anhydrase (BCA) immobilized on a pore-expanded SBA-15 support was investigated. SBA-15 was synthesized using TMB as a pore expander, and the resulting porous silica was characterized by XRD, BET, IR, and FE-SEM analysis. BCA was immobilized on SBA-15 through various approaches, including covalent attachment (BCA-CA), adsorption (BCA-ADS), and cross-linked enzyme aggregation (BCA-CLEA). The immobilization of BCA on SBA-15 was confirmed by the presence of zinc metal in the EDXS analysis. The effects of pH, temperature, storage stability, and reusability on the biocatalytic performance of BCA were characterized by examining para-nitrophenyl acetate (p-NPA) hydrolysis. The $K_{cat}/K_m$ values for p-NPA hydrolysis were 740.05, 660.62, and $680.11M^{-1}s^{-1}$, respectively, where as $K_{cat}/K_m$ for free BCA was $873.76M^{-1}s^{-1}$. The amount of $CaCO_3$ precipitate was measured quantitatively using anion-selective electrode and was found to be 12.41, 11.82, or 11.28 mg $CaCO_3$/mg for BCA-CLEA, BCA-ADS, or BCA-CA, respectively. The present results indicate that the immobilized BCA-CLEA, BCA-ADS, and BCA-CA are green materials, and are tunable, reusable, and promising biocatalysts for $CO_2$ sequestration.

• 한국미생물·생명공학회지
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• 제46권3호
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• pp.234-243
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• 2018

남극해에는 산업적으로 유용한 신규 효소촉매를 생산하는 미생물들이 들어 있다. 우리는 로스해(Ross Sea)로부터 분리한 여러 저온성 박테리아를 조사하였으며, 그 중에서 지방분해 능력이 뛰어난 Croceibacter atlanticus (No. 40-F12)를 찾았다. Shotgun 클로닝 방법으로 리파아제 유전자(lipCA)를 찾았으며 Escherichia coli 균에서 LipCA 효소를 발현하였다. Spain Arreo metagenome alpha/beta hydrolase를 기준으로 LipCA 상동구조모델을 만들어서 분석한 결과, ${\alpha}/{\beta}$ hydrolase fold, Gly-X-Ser-X-Gly motif, 그리고 lid 구조를 갖고 있기 때문에 전형적인 리파아제 효소임이 밝혀졌다. Ammonium sulfate 침전법과 겔여과 크로마토그래피를 통해서 세포추출액으로부터 LipCA 효소를 순수하게 분리한 후, 최적 온도, pH, 안정성, 기질특이성, 유기용매 안정성 등의 효소특성을 규명하였다. LipCA를 cross-linked enzyme aggregate (CLEA) 방법으로 고정화하고 효소특성을 조사, 비교하였다. 고정화를 통해 온도, pH, 유기용매에 대한 안정성이 증가하였고 기질특이성의 변화는 관찰되지 않았다. $LipCA^{CLEA}$는 원심분리 방법으로 쉽게 회수되었고 4번의 재사용 후에 40% 이상의 활성이 잔재하였다. 이 논문은 C. atlanticus 리파아제의 발현, 특성규명, Cross-linked Enzyme Aggregated 고정화를 바탕으로 안정성을 높여 산업적 활용 가능성을 제시한 최초의 보고이다.

• 분석과학
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• 제29권3호
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• pp.105-113
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• 2016

고정화 지지체로 사용된 실리카 나노입자와 실리카 코팅된 자성 나노입자에 작용기를 부착시켜 기능성을 부가한 후 효소인 리파아제를 고정화하여 리파아제의 안정성을 향상시키고자 연구를 수행하였다. 지지체에 부착하는 작용기가 고정화된 효소의 활성과 안정성에 미치는 영향도 살펴보았다. 실리카 나노입자와 실리카 코팅된 자성 나노입자에 부착한 작용기인 epoxy group과 amine group은 glycidyl methacrylate과 aminopropyl triethoxysilane을 통해 실리카 나노입자와 실리카 코팅된 자성 나노입자 표면에 각각 부착하였다. 작용기가 부착된 실리카 나노입자와 실리카 코팅된 자성 나노입자에 고정화한 Candida rugosa lipase는 자유효소에 비해 초기반응속도는 다소 낮았지만, 3 회 재사용한 후 측정한 활성이 최초 활성 대비 92 % 이상의 활성을 유지하였다. 또한, 실리카 코팅된 자성 나노입자에 glutaraldehyde를 이용한 cross-linked enzyme aggregate (CLEA) 방법과 공유결합법을 통해 라파아제를 각각 고정화한 연구를 수행한 결과, 실리카 나노입자와 실리카 코팅된 자성 나노입자에 CLEA 방법과 공유결합법으로 각각 고정화한 Candida rugosa lipase는 자유효소에 비해 초기반응속도 뿐만 아니라 최종 활성도 높았고, 5 회 재사용한 후 측정한 활성이 최초 활성 대비 73 % 이상의 활성을 유지하였다.

• 한국지하수토양환경학회지:지하수토양환경
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• 제12권1호
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• pp.53-63
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• 2007

우리나라는 최근에 토양위해성평가 지침을 마련하였으며, 앞으로 토양위해성모델 개발에 대한 필요성이 대두되고 있다. 선진국에서는 자국 내 부지특성과 노출경로를 고려한 토양위해성평가 모델을 토양정책 전반에 활용하고 있다. 본 연구에서는 선진국에서 위해성평가에 이용되는 대표적인 오염토양 위해성평가 모델을 비교분석하였다. 연구대상이 된 모델은 미국, 영국, 네덜란드에서 사용하고 있는 CalTOX, CLEA, CSOIL로서, 노출경로, 토지이용도 그리고 노출량 산정식을 중심으로 비교분석하였다. 모델 검토시 우선적으로 비교 분석된 항목은 노출시나리오, 노출경로, 입력변수의 공통사항이며, 이러한 분석결과를 토대로 선진국의 토양위해성 모델들이 공통적으로 포함하고 있는 노출경로를 추출하여, 국내에 적용 가능한 토양 위해성평가 모델개발의 기초자료로 제안하였다. 인체노출량 산정식에서는 일반적으로 미국식 방법이 국내 상황에서 사용이 용이한 것으로 판단되며, 비산먼지나 휘발물질 흡입의 경우는 네덜란드식이 기본값이 제공되어 있으므로 사용하기가 편리할 것으로 판단된다.

• Journal of Microbiology and Biotechnology
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• 제18권3호
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• pp.465-471
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• 2008

Highly active, stable, and magnetically separable immobilized enzymes were developed using carboxymethyl cellulose (CMC) and diethylaminoethyl cellulose DEAE-C; hereafter designated "DEAE" as supporting materials. Iron oxide nanoparticles penetrated the micropores of the supporting materials, rendering them magnetically separable. Lipase (LP) was immobilized on the surface of the supporting materials by using cross-linked enzyme aggregation (CLEA) by glutaraldehyde. The activity of enzyme aggregates coated on DEAE was approximately 2 times higher than that of enzyme aggregates coated on CMC. This is explained by the fact that enzyme aggregates with amine residues are more efficient than those with carboxyl residues. After a 96-h enantioselective ibuprofen esterification reaction, 6% ibuprofen propyl ester was produced from the racemic mixture of ibuprofen by using DEAE-LP, and 2.8% using CMC-LP.