• 한국미생물·생명공학회지
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• 제14권3호
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• pp.209-212
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• 1986

YEp 13 plasmid에 B. amyloliquefaciens의 $\alpha$-amylase gene을 cloning시켜서 얻은 hybrid plasmid를 E. coli C 600으로 형질전환시켜서 amylase 활성을 나타내는 균주를 선별하였다. 선별된 E. coli C 600균주를 plasmid추출하여 전기영동해 본 결과 plasmid가 매우 불안정하였으며, 그중 가장 단순한 plasmid band를 지니고 있으며 amylase활성이 강한 E. coli균주를 선별하였다. 선별된 균주의 균체내에 있는 2개의 plasmid DNA를 분리하여 각각의 plasmid를 pTG 17-1, pTG 17-2로 명명하였으며 S. cerevisiae MC 16에서 형질전환이 가능한 pTG 17-2 DNA를 제한효소 EcoRI과 Pst I으로 restriction한 결과 EcoRI으로 처리한 경우는 7.3, 4.8, 2.4 kb인 3개의 분획으로 나타났으며 Pst I으로 처리한 경우는 linear로 14.5kb임을 알았으며 이로써 pTG 17-2 plasmid의 size가 약 14kb임을 알았다. 또한 E.coli균체내에서의 ampicillin sensitive로써 이 plasmid의 ampicillin resistance site가 결실되었음을 알았고 효모의 형진전환체로 부터의 $\alpha$-amylase는 균체외로 분비되지 않았고 효모균체내의 $\alpha$-amylase는 Somogyi-Nelson방법과 Agar diffusion 방법으로 확인하였다.

• Journal of Microbiology and Biotechnology
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• 제31권4호
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• pp.570-583
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• 2021

Pyrococcus furiosus α-amylase can hydrolyze α-1,4 linkages in starch and related carbohydrates under hyperthermophilic condition (~ 100℃), showing great potential in a wide range of industrial applications, while its relatively low productivity from heterologous hosts has limited the industrial applications. Bacillus subtilis, a gram-positive bacterium, has been widely used in industrial production for its non-pathogenic and powerful secretory characteristics. This study was conducted to increase production of P. furiosus α-amylase in B. subtilis through three strategies. Initial experiments showed that co-expression of P. furiosus molecular chaperone peptidyl-prolyl cis-trans isomerase through genomic integration mode, using a CRISPR/Cas9 system, increased soluble amylase production. Therefore, considering that native P. furiosus α-amylase is produced within a hyperthermophilic environment and is highly thermostable, heat treatment of intact culture at 90℃ for 15 min was performed, thereby greatly increasing soluble amylase production. After optimization of the culture conditions (nitrogen source, carbon source, metal ion, temperature and pH), experiments in a 3-L fermenter yielded a soluble activity of 3,806.7 U/ml, which was 3.3- and 28.2-fold those of a control without heat treatment (1,155.1 U/ml) and an empty expression vector control (135.1 U/ml), respectively. This represents the highest P. furiosus α-amylase production reported to date and should promote innovation in the starch liquefaction process and related industrial productions. Meanwhile, heat treatment, which may promote folding of aggregated P. furiosus α-amylase into a soluble, active form through the transfer of kinetic energy, may be of general benefit when producing proteins from thermophilic archaea.

• International Journal of Industrial Entomology and Biomaterials
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• 제8권2호
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• pp.145-149
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• 2004

The expression of a fusion protein comprised of the B. thuringiensis crystal protein, Cry1Ac, and enhanced green fluorescent protein (EGFP) in Escherichia coli XLl-blue was examined. Three recombinant plasmids were transformed into E. coli XL1-blue and named as ProAc/Ec, MuEGFP/Ec and ProMu-EGFP/Ec, respectively. All transformants were observed by light and fluorescence microscopy at mid-log phase. The expression in E. coli transformants, ProMu-EGFP/Ec and MuEGFP/Ec, exhibited bright enough fluorescence to be observed. Furthermore, ProMu-EGFP/Ec produced fluorescent inclusions, which may have been recombinant crystals between EGFP and Cry1Ac while MuEGFP/Ec expressed soluble EGFP in cell. In SDS-PAGE, ProAc/Ec had 130 kDa crystal protein band and MuEGFP/Ec had thick 27 kDa EGFP band. However, ProMu-EGFP/Ec had about 150 kDa fusion protein band. Accordingly, these results indicated that a fusion protein between the B. thuringiensis crystal protein and a foreign protein under the lacZ promoter was successfully expressed as granular structure in E. coli. It is suggested that the E. coli expression system by N-terminal fusion of B. thuringiensis crystal protein may be useful as excellent means for fusion expression and characterization of B. thuringiensis fusion crystal protein.

• International Journal of Industrial Entomology and Biomaterials
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• 제1권2호
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• pp.123-129
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• 2000

Expression of the crylAcl gene of an acrystalliferous Bacillus thuringiensis strain under the control of the native or $\alpha$-amylase gene promoter was investigated. The crylAcl gene was cloned in a B. thuringiensis - E. coli shutle vector, pHT3101, undder the control of either the native promoter (pProAc) or the $\alpha$-amylase promoter from Bacillus subtilis (pAmyAc). These two recombinant plasmids were successfully expressed in B. thuringiensis subsp. kurstaki Cry B. The first transformant (ProAc/CB), harboring pProAc, expressed an about 130 kDa protein begining 24 hr after inoculations just as in the case of the wild type of B. thuringiensis subsp. kurstaki HD-73. The second pAmyAc-transformant (AmyAc/CB) began to express the gene just 6 hr after inoculation, but Western analysis showed that the activity of the $\alpha$-amylase promoter was relatively weaker than that of the native promoter. As expected, their toxicity against Plutella xylostella larvae was dependent on the amount of Cry1Acl protein expressed.

• 미생물학회지
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• 제38권4호
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• pp.241-246
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• 2002

Bacillus circulans의 endo-$\beta$-1,3-1,4-glucanase유전자를 발현 vector pQE30에 삽입시키고 E. coli Ml5에서 발현시켜 효소를 생산.정제하였다. 생산된 endo-$\beta$-1,3-1,4-glucanase는 nickel-nitrilotriacetic acid (Ni-NTA) metal-affinity chromatography 과정을 거쳐 단일 단백질로 정제되었다. 정제된 효소의 분자량은 SDS-PAGE 전기영동법으로는 28 kDa이었다. 효소 최적 활성 pH와 온도는 각각 pH 6.8과 $60^{\circ}C$였다. 이 효소는 pH 5.5～7.5와$55^{\circ}C$ 이하의 온도에서 안정하였다. 또한 본 효소는 여러 가지 금속 이온에 의해 대부분의 활성이 억제되었고, 특히 $Hg^{2+}$에서는 강하게 효소 활성이 저해됨을 보였다. 유기 용매에 대한 활성은 10%의 methanol이나 ethanol, isopropanol, 1-butanol 에 대하여 모두 낮은 활성을 나타내었다.

• Journal of Microbiology and Biotechnology
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• 제18권1호
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• pp.160-166
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• 2008

A DNA fragment containing 2,079 base pairs from Bacillus circulans CGMCC 1416 was cloned using degenerate PCR and inverse PCR. An open reading frame containing 981 bp was identified that encoding 326 amino acids residues, including a putative signal peptide of 31 residues. The deduced amino acid sequence showed the highest identity (68.1%) with $endo-{\beta}-1,4-D-mannanase$ from Bacillus circulans strain K-1 of the glycoside hydrolase family 5 (GH5). The sequence encoding the mature protein was cloned into the pET-22b(+) vector and expressed in Escherichia coli as a recombinant fusion protein containing an N-terminal hexahistidine sequence. The fusion protein was purified by $Ni^{2+}$ affinity chromatography and its hexahistidine tag cleaved to yield a 31-kDa ${\beta}$-mannanase having a specific activity of 481.55U/mg. The optimal activity of the purified protein, MANB48, was at $58^{\circ}C$ and pH 7.6. The hydrolysis product on substrate locust bean gum included a monosaccharide and mainly oligosaccharides. The recombinant MANB48 may be of potential use in the feed industry.

• 미생물학회지
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• 제39권3호
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• pp.141-147
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• 2003

여러 항진균 활성 관련 유전자들의 발현 수준을 동시에 연구하기 위하여 DNA microarray를 이용하여 유전자들의 발현 패턴을 비교 분석하였다. 본 연구에서는 항진균활성을 가지는Bacillus lentimorbus WJ5의 genomic DNA를 무작위 하게 제한효소로 절단하여 2,000개의 DNA단편을 microarray하였으며, 감마선($^{60}Co$)조사로 유도된 7종의 항진균 활성 결핍 돌연변이체와 발현양상을 정량적으로 비교하였다. Gene Cluster (Michael Risen, Stanford Uniy.)를 이용한 DNA microarray의 분석 결과, 총 408개의 DNA 단편이 발현되는 것을 확인할 수 있었으며, 이들 중 20개의 DNA단편이 항진균 활성 결핍 돌연변이체에서 발현이 억제되는 것으로 나타났다. 특히,pbuX (xanthine permease, K222), ywbA (phosphotransferase system enzyme II, K393), ptsG (PTS glucose specific enzyme II ABC component, K877), yufO (ABC transporter(ATP-binding protein), K1301), 그리고 ftsY (signal recognition particle (docking protein), K868)는 모든 돌연변이체에서 동시에 발현되는 down-regulation된 유전자들로서 물질 이동과 관련된 것으로 보고되어 있으며, 항진균 활성 관련 신호 및 물질의 이동에 관여할 것으로 사료되어진다.

• 대한한의학회지
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• 제38권3호
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• pp.30-42
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• 2017

Objectives: The purpose of this study was to investigate the effects of Angelica gigas Nakai extract(AGNE) and Bacillus polyfermenticus KJS-2 (BP2) on atopic dermatitis (AD) induced by 2, 4-dinitrochlorobenzene (DNCB) in mice. Methods: In the experiment, we divided mice into four groups: a control group, a DNCB group, an AGNE group, and an AGNE+BP2 group. Then we examined the changes in scratching frequency, clinical aspects on dorsum skin, immunoglobulin (IgE), cytokines ($TNF-{\alpha}$, IL-6) and expression of COX-2. Resutls: From the experiment, the scratching frequency was significantly dropped in AGNE group and AGNE+BP2 group. Clinical observations of dorsum skin, there were a severe keratotic lesion and drop of dead skin cell in DNCB group, but symptoms of AD were decreased 39.6% in AGNE group and 49.6% in AGNE+BP2 group during 3 weeks. IgE, $TNF-{\alpha}$ and IL-6 were decreased significantly in both AGNE and AGNE+BP2 group. Expression of COX-2 was also decreased significantly in both groups. Conclusions: In conclusion, these data suggest that AGNE can decrease symptoms of AD and BP2 makes AGNE more effective. So AGNE can be useful herbal therapy for AD.

• KSBB Journal
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• 제16권4호
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• pp.415-419
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• 2001

Bacillus subtilis WB700에서 P43 프로모터를 사용하여 staphylokinase를 생산하기 위하여 배지 최적화 및 회분식 배양과 유가식 배양 두가지 시스템을 비교하였다. 여러 가지 질소윈 중에서는 tryptone이 가장 좋은 질소원 이었으며, MSR 배지를 사용한 경우 tryptone 15 g/L일 경우에 최적조건임을 알아내었다. MSR 배지에시 포도당을 제한 기질로 사용할 경우는 5 g/L일 때가 SAK의 발현에 최적 조건이었다. MSR 배지를 기본으로 이용하여 포도당 공급을 조절함으로서 발효조 내의 DO를 30%로 유지한 결과 오히려 MSR 배지를 이용하여 회분식 발효를 한 경우보다 좋지 못한 결과를 얻었으며, 이는 B. subtilis 숙주의 영양요구적 특이성과 P43 promoter의 stress 발생시 주 발현되는 특성 등에 기인한 것이라고 사료된다. MSR 배지를 이용하여 회분식 발효를 하였을 때 SAK 활성은 2880 unit이었고, 이때 배지 내로 분비된 SAK 농도는 455 mg/L이었다.

• 한국미생물·생명공학회지
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• 제39권1호
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• pp.9-19
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• 2011

Bacillus subtilis의 pyrimidine biosynthetic (pyr) operon은 UMP의 de nove 생합성에 관여하는 enzyme들을 encode할 뿐만 아니라, 조절단백질인 PyrR도 encode한다. PyrR은 pyr mRNA-binding 조절 기능과 uracil phosphoribosyltransferase activity를 동시에 가지는 bifunctional 단백질이다. 본 연구에서는 Proteomic analysis를 이용하여 Uracil - 환경에서 DB104${\Delta}$pyrR의 단백질 패턴을 분석하여 단백질 레벨에서 PyrR 단백질의 실질적인 조절 양상을 관찰하였다. 두 균주의 세포질 단백질은 다양한 발현의 차이를 보였으며, Silver 염색된 2D-gel의 pI 4~10 사이에서는 1,300여개의 단백질이 검출되었으며, 단백질 발현 차이를 보이는 172개의 spot 중에서 42개의 단백질이 identification 되었다. 그 결과 pyr operon의 단백질(PyrAa, PyrAb, PyrB, PyrC, PyrD, and PyrF)이 모두 Up regulation이 이루어지고 있음을 확인할 수 있었으며, 이것은 단백질 레벨에서 Pyrimidine 생합성 과정이 PyrR에 의해서 정확히 Regulation 되어짐을 확인할 수 있었다. 또한 Pyrimidine 생합성의 Up regulation과 Down regulation 상태의 단백질의 패턴 양상도 분석할 수 있게 되었다. Pyrimidine의 생합성 과정은 DNA를 구성하는 기본적인 구성 요소를 생산하는 과정으로서 여러가지 Metabolism 가운데 중요한 위치를 차지하고 있다. 만약 Pyrimidine의 생합성 과정이 Over- expression된다면 다른 Metabolism의 균형에도 변화가 올 것이다. Proteomics Analysis에 이용한 DB104${\Delta}$pyrR 균주는 Pyrimidine 생합성의 조절에 관여하는 PyrR knock out 균주로서 Uracil - 환경에서는 전체적인 Pyrimidine 생합성 조절이 Up regulation이 되어지므로 Up regulation 동안 어떤 Metabolism에 영향을 주는지 관찰을 할 수 있게 되었다. 특히 Amino Acid Metabolism에 관계있는 단백질의 Up regulation이 이루어짐을 관찰할 수 있었으며 이것은 현재 각광을 받고 있는 단백질 산업에 응용함으로써 산업적으로 많은 기대를 할 수 있을 것으로 예상되어진다.