홀아비꽃대(Chloranthus japonicus) 뿌리 조직의 메탄을 추출물은 벼 도열병(Magnaporthe grisea), 벼 잎집무늬마름병(Corticium sasaki), 토마토 잿빛곰팡이병(Botrytis cinerea), 토마토 역병(Phytophthora infestans) 및 밀 붉은녹병(Puccinia recondita) 등의 다양한 식물병을 효과적으로 방제하였다. 이 메탄올 추출물로부터 3개의 항균물질을 분리하였고 이들은 질량분석과 핵자기공명분석을 통하여 shizukanol B, C 및 D로 동정되었다. 이들 세 개의 물질들 중에서 shizukanol C가 실험한 식물병원균들의 균사생육 저해 활성이 가장 큰 것으로 나타났다. 즉, $12.5{\mu}g/m\ell$ 이상의 농도에서 벼 도열병균과 고추 탄저병균(Colletotrichum gloeosporioides와 C. acutatum)의 균사 생육을 완전히 억제하였고, $3.13{\mu}g/m\ell$ 이상의 농도에서는 토마토 역병균의 균사 생육이 완전히 억제되었다. 세 가지 물질은 또한 in vivo에서 벼 도열병과 밀 붉은녹병에 대하여 특히 높은 방제효과를 보였다. 다른 한편으로 세 가지 물질들은 밀과 보리 잎에 약해를 유발하였고, 또한 좀개구리밥(Lemna paucicosta)의 생장을 억제하였으며, shizukanol B, C, D의 50% 생육억제 농도는 각각 $30.0{\mu}g/m\ell$, $49.9{\mu}g/m\ell$ 및 $154{\mu}g/m\ell$였다. 그리고 shizukanol C는 시험한 5종류의 해충중에서 벼멸구(Nilaparavata lugens), 복숭아혹진딧물(Myzus persicae), 배추좀나방(Plutella xylostella) 및 담배거세미나방(Spodoptera litura)에 대해서 $1,000{\mu}g/m\ell$ 수준에서 60% 이상의 살충활성을 보였다.
세계의 버섯 생산량은 매년 10-20% 증가해 왔으며 다품목화 되어가고 있다. 최근에는 큰느타리, 백령느타리 등이 새로운 품목으로 재배 면적이 증가하고 있다. 우리나라에서는 고려시대 저술한 김부식의 삼국사기(1145년)에 처음으로 금지(영지)와 서지가 기록되었고, 조선시대에는 16종류 이상의 농서 또는 의학서에서 버섯의 이용이 기록되었다. 상업적으로 이용되는 버섯으로는 지금까지 25종의 160품종이 보급되었다. 하지만 품종보호등록은 8품종만이 이루어져 아주 적은 편이다. 버섯산업이 1960년대 수출산업으로 육성되면서 자실체 생산량은 계속 증가해왔다. 2003년에는 181,828톤으로 생산가액 약 8,000억원을 능가할 것으로 추정된다. 버섯의 유효성분이 많이 알려지고 있는데 항균, 항염증, 항종양, 항바이러스, 항세균과 항기생물, 혈압조절, 심장혈관 장애 방지, 콜레스테롤 과소혈증과 지방과다 혈증 방지, 항당뇨, 면역조절, 강신장, 간장 독성 보호, 신경섬유 활성화, 생식력 증진의 효과가 있다. 따라서 버섯 의약품, 건강음료, 가공식품, Biotransformation에 의한 신기능성 제품 개발 등이 이루어지고 있다. 또한 버섯은 환경정화 기능이 뛰어나 환경오염 물질의 정화가 가능하며, 버섯재배후 배지를 이용하여 퇴비생산, 가축사료 생산에 이용된다. 한국의 버섯산업은 이미 가장 빨리 성장하는 농업 투자분야로 되었다. 그러나 버섯산업의 국제 경쟁력 강화를 위하여 국내고유의 품종개발에 의한 품종보호등록이 시급하다. 또한 저렴한 생산기술 개발과 유통구조 개선에 의한 생산량 조절이 이루어져야 버섯산업이 더욱 발전할 수 있을 것이다.
식물 근권미생물은 식물의 뿌리 표면과 내부에 정착하면서 식물생장 촉진물질을 분비하여 식물생육에 직접적인 영향을 주거나, 항균물질을 분비하여 병원균으로부터 식물 근권환경을 보호하여 식물의 생육을 촉진하게 된다. 이러한 활성을 갖고 있는 미생물을 분리하여 동정하며, 항균물질을 분리, 동정하여 지속농업의 발전과 농업환경의 보전을 위하여 연구를 실시하였다. 논토양으로부터 식물생육촉진활성과 항균활성을 갖는 RRj 228균주를 분리하여, 생리 생화학적방법과 유전학적 방법으로 동정한 결과, Pseudomonas sp.로 동정되었다. RRj 228균주는 B. cinerea, P. ultimum, P. capsici와 R. solani에도 높은 항균활성을 보였으며, 특히 고추탄저병원균인 C. acutatum에 강력한 항균활성을 나타냈다. RRj 228균의 배양여액을 C. acutatum, R. solani 및 P. ultimum에 대한 $ED_{50}$값을 측정한 결과 0.14, 0.16, 0.29 mg/ml로 나타났다. 항균활성물질은 RRj 228 배양여액으로부터 각종 크로마토그라피법으로 순수분리하고, NMR과 GC/MS 등의 기기분석을 실시하여 구조를 Phenazine-1-carboxylic acid (분자량 224)로 동정하였다.
이삭마름병은 지금까지 화학살균제에 의해 방제되어 왔지만 잔류농약 문제로 인하여 합성농약의 사용은 곡류 수확 30일 전까지로 그 처리기간이 제한되어 있다. 따라서 수확 직전까지 처리가 가능한 새로운 생물농약의 개발이 필요하다. 본 연구에서는 이삭마름병 방제를 위하여 F. graminearum에 대하여 항균활성을 보이는 식물추출물을 선발하기 위하여 총 85과에속하는 225 한약재시료의 ethanol 추출물을 대상으로 F. graminearum 포자발아 억제효과를 조사하였다. 그 결과 높은 억제활성을 가진 대계근을 선발한 후, 용매 분획, 컬럼 크로마토그래피와 생물검정을 거쳐 F. graminearum 포자발아 억제활성을 가진 두 개의 화합물을 분리하였다. 두 물질은 질량분석과 핵자기공명분석을 통하여 ciryneol C와 1-heptadecene-11,13-diyne-8,9,10-triol의 polyacetylene계 화합물로 동정되었다. F. graminearum의 포자발아 저해활성을 나타내는 $IC_{50}$은 1-heptadecene-11,13-diyne-8,9,10-triol이 $3.17{\mu}g/ml$, ciryneol C는 $28.14{\mu}g/ml$로 1-heptadecene-11,13-diyne-8,9,10-triol의 저해활성이 ciryneol C보다 더 높았다. 또한 온실에서의 대계근 EtoAc 추출물 분말수화제의 밀 이삭마름 병방제효과는 250배와 500배희석액처리시각각 78.92%와 31.56%로 유효성분의 농도가 높을수록 방제효과도 높아졌다. 본 연구결과는 polyacetylene계 화합물을 함유하는 대계근의 조추출물이 이삭마름병 방제를 위한 식물유래 천연물 살균제로 사용이 가능하다는 것을 제시하고 있다.
안산지역의 하천 침전 토양에서 식물병원성진균에 대한 길항능력이 좋은 세균을 분리하였다. 이들 중 한 균주가 Rhizoctonia solani, Botrytis cenerea와 Fusarium oxysporum의 생장을 저해하는 활성을 보였다. 이 균주는 표현 형질과 분자계통학적인 특징에 의거하여 Pandoraea sp.로 동정되었다. 그리고 생육 최적 조건을 검토한 결과 tryptone과 sucrose가 각각 최적 질소원과 탄소원임을 확인할 수 있었으며, 최적 pH와 온도는 각각 pH 7.0 와 $30^{\circ}C$임이 확인되었다. Pandoraea sp. BCNU 315가 생성하는 물질들은 column chromatography로 정제하였고 고속액체크로마토그래피(HPLC), GC-MS 그리고 핵자기공명(NMR) 장치로 구조를 분석하였다. 그 결과 한 화합물은 indole이었으며 또 다른 화합물은 cyclopentadecaheptehe임이 추정되었다. 한편 Pandoraea sp. BCNU 315가 생성하는 6개의 화합물 중 나머지 4개 화합물의 자세한 구조 해석은 추후 연구를 통하여 밝혀져야 할 것이다.
Melithiazol은 점액세균 Melitangium lichenicola, Archangium gephyra, Myxococcus stipitatus에 의해 생산되는 항진균 물질이다. M. lichenicola의 melithiazol 생합성 유전자는 이미 알려져 있지만, A. gephyra와 M. stipitatus의 melithiazol 생합성 유전자들은 아직까지 밝혀져 있지 않다. 본 연구에서는 유전체 서열 분석과 돌연변이 분석을 통해 M. stipitatus DSM 14675 균주로부터 37.3 kb 크기의 melithiazol 생합성 유전자군을 발견하였다. 이 유전자군은 9개(MYSTI_04973−MYSTI_04965)의 유전자로 구성되어 있는데, 4개의 polyketide synthase 모듈과 3개의 non-ribosomal peptide synthase 모듈, 그리고 fumarylacetoacetate hydrolase, S-adenosylmethionine-dependent methyltransferase, nitrilase를 암호화하는 것으로 분석되었다. 플라스미드 삽입 돌연변이를 통해 MYSTI_04972 유전자 또는 MYSTI_04973를 불활성화시켰을 때 melithiazol 생산능이 상실되었다. MYSTI_04972부터 MYSTI_04965까지의 8개 유전자가 암호화하는 melithiazol 생합성 모듈의 구성은 M. lichenicola Me l46에서와 유사하였다. 하지만 첫 번째 유전자(MYSTI_04973)에 의해 암호화되는 로딩 모듈의 구성은 M. lichenicola Me l46과 달랐는데, 이러한 차이는 M. stipitatus 균주들이 어떻게 M. lichenicola Me l46과는 다른 구조의 melithiazol 유도체들을 생산하는지 설명해준다.
방선균은 그램양성 토양 박테리아로서 항생제, 항암제, 항구충제, 면역억제제 등 유용한 2차 대사산물을 생산하는 유용 산업미생물이다. 비록 대부분의 방선균이 속해있는 스트렙토마이세스는 지난 수 십 년간 분자수준에서의 연구가 집중적으로 진행되어 왔으나, 최근에 분리된 잠재적 유용성을 갖는 스트렙토마이세스 이외의 희소방선균들은 유전자 조작시스템의 부재로 그 특성이 잘 규명되지 않고 있다. 본 연구에서는 독립적으로 분리된 180 여 방선균주들 중에서 희소방선균만을 선별하기 위하여 중합효소연쇄반응을 이용한 유전체 스크리닝 전략을 시도하였으며, 이 전략을 통하여 7종의 희소방선균을 성공적으로 분리하였다. 특히 여러 생리활성 테스트를 통하여, 항진균 및 항생제 활성을 띄는 잠재적 유용성이 높은 노카이디옵시스 균주 MMBL010을 선별하였다. 또한 전통적인 방선균 유전자 조작기법이 작동하지 않는 본 MMBL010 균주를 대장균 접합을 통한 유전자 전달 시스템도 최적화시킴으로써, 유전체 스크리닝을 통한 유용희소방선균의 선별 및 유전자 조작시스템 구축은 궁극적으로 희소방선균의 잠재적 유용성을 극대화시킬 수 있는 효율적인 전략으로 사료된다.
근권토양으로부터 고추역병균을 포함한 다양한 식물 병원성 곰팡이에 대하여 항균활성이 강한 세균을 분리하였다. 이 세균은 16S rRNA gene서열 분석 결과 Lysobacter enzymogens로 동정되었고 LE429로 명명 하였다. LE429는 chitinase, ${\beta}-1$, 3-glucanase, protease, gelatinase, lipase 및 항생물질과 같은 다양한 이차대사산물을 분비하였다. 항생물질은 diaon HP-20 및 sephadex LH-20 컬럼크로마토그래피 및 HPLC로 정제하여, GC-EI 및 GC-CI분석을 통하여 phenylacetic acid로 동정되었다. Field 실험에서 LE429의 고추 병해 억제 효과를 조사하기 위해 LE429배양액(CB), Neem oil 용액 (NO), LE429배양액과 Neem oil 용액을 섞은 혼합액(CB+NO), 그리고 대조구로서 물(CON)을 각각 고추에 처리하였다. 고추의 수량구성요소는 일반적으로 CB 처리구가 가장 높았고, CB+NO, CON 그리고 NO 순서로 나타났다. CB 처리구에서 병원성 곰팡이는 강하게 억제 되었지만, 몇몇 해충이 발견되었다. NO 처리구에서는 해충은 발견 되지 않았지만, 병원성 곰팡이가 발견 되었다. 하지만, CB+NO 처리구에서 병원성 곰팡이 및 해충이 전혀 발견 되지 않았다. 결론적으로, 2차 대 사산물을 생산하는 LE429와 Neem oil의 혼합액은 고추에 발생하는 병원성 곰팡이와 해충에 대한 좋은 생물학적 방제제가 될 수 있다고 사료된다.
다기능 식물생장촉진근권세균(PGPR)인 P. fluorescens 2112 균주가 고추의 생물방제와 성장촉진에 긍정적인 영향을 주기 위해서는 생물막을 형성하여 근권에 정착하는 colonization이 필수조건이다. 따라서 근권정착능에 주요한 생물막 형성에 필요한 quorum sensing의 신호분자인 AHLs의 생산 유무를 조사한 결과, petri dish bioassay에서 AHLs를 생산하여 푸른색환을 형성하는 것을 확인할 수 있었으며 아울러 P. fluorescens 2112 균주의 생장곡선에서 대수증식기 중반에서 정체기 초반에 가장 많은 AHLs를 생산함을 확인하였다. 또한 탄소길이가 6개인 AHLs를 생산한다는 사실을 TLC bioassay를 통해 확인하였다. 그리고 고추의 뿌리 및 근권토양에서의 정착밀도를 Double layer filter paper와 Ahmad와 Baker 법으로 분석하여 확인하였다. 그 결과, 뿌리 상단과 말단에서 각각 $3{\times}10^5$ CFU/g root와 $8{\times}10^3$ CFU/g root로 확인되었으며, 근권토양에서 균주는 표면으로부터 가까운 1 cm 깊이에서는 $3.5{\times}10^6$ CFU/g soil의 높은 밀도로 존재하였으나, 먼 5 cm 깊이의 근권토양에서는 $1.1{\times}10$ CFU/g soil의 낮은 밀도로 존재하였다. 그리고 주사전자현미경을 통해 고추 뿌리의 표피 및 말단에서 처리한 균주가 생물막 형태의 군집을 형성하는 것을 확인하였다. 결과적으로 P. fluorescens 2112 균주가 AHLs를 생산하여 quorum sensing이 이루어졌으며, 이로 인해 고추의 뿌리에 생물막과 유사한 군집을 형성하여 고밀도로 colonization이 일어났을 것으로 생각된다. 따라서 P. fluorescens 2112 균주의 특징인 다양한 항진균 물질과 auxin을 생산함과 동시에 colonization을 통해 고추의 생육촉진이나 생물방제에 긍정적인 효과를 줄 수 있을 것이다.
Bacillus LPO3 (계면활성제와 같이 유화물질을 생산하는)을 hydrocarbon을 감소시키는 bio-control agent로 사용했다. 토양 (시중구입)은 gasoline을 섞어 오염시킨 토양을 사용하였다. 13일 동안 bacteria의 성장, hydrocarbon의 감소, 그리고, Bacillus LP03 의 작물 성장에 미친 요인(식물의 싹과 뿌리의 길이를 포함한)을 관찰하였다. 우리는 이 bacteria의hydrocarbon을 감소 시키는 물질로서 이 균이 생산하는 계면활성제일 것이라는 가능성을 이미 확인 하였으며 이는 식물의 싹과 뿌리의 생장을 촉진하였고, 회색 곰팡이에 대하여항 진균 활성을 보였다. 본 연구에서는 bacteria를 넣지 않은 기름으로 오염된 토양 실험 군에서는 식물이 자라나지 않았을 뿐 아니라 살아남지도 못했다. 실험 결과로 볼 때, gasoline의 hydrocarbon이 시간이 지남에 따라 감소되었고, RNA blotting실험에서는 오염된 토양에서 균의 증식과 더불어 계면활성제관련 유전자 산물의 증가를 확인하였다 결과적으로, 이 bacteria (계면활성제를 생산하는)는 회색 곰팡이에 감염된 토양이나 기름으로 오염된 토양에서 작물이 자랄 수 있게 하기 위한 bio-control agent로서 유효한 균으로 생각된다.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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