간염 보균자의 혈액으로부터 Dane 입자를 분리하였다. Dane 입자의 핵으로부터 분리해낸 DNA는 $\alpha$-($^{32}$P) dNTP 존재하의 DNA 폴리머레이즈 반응 후 액체 씬틸레이션 카운터와 한천 전기영동 및 가이거 뮐러 카운터에 의하여 간염의 DNA임이 확인되었다. 간염 바이러스에 의한 감염을 막기 위한 백신으로서의 B형 간염 바이러스 표면항원을 생산하기 위하여 산성포스파테이즈 프로모터를 갖는 재조합 프라스미드를 함유하는 효모균주를 사용하였다. 재조합 프라스미드는 pHBV 130 및 pAM 82로부터 제작되었으며 대장균에 변환되어진 후 효모균주에 전달되었다. 간염 표면항원은 조절된 무기 인산 농도하에서 버크홀더 최소배지에서의 저해 해제로 생산되었다. 간염 표면항원의 생산 속도도 조사하였다. 전체 간염 표면항원 활성은 인산이 없는 배지에 옮겨진 뒤 3시간 내지 6시간에서 급격히 증가하였으며 9시간째에 최대에 도달하였다. 인산이 없는 배지에 옮기는 것은 고농도 인산 배지에서의 세포 배양을 6시간동안 수행한 뒤에 하는 것이 최적의 결과를 나타내었다.
출아 효모인 Saccharomyces cerevisiae의 베타-1,3-글루칸 생합성의 결함을 초래하는 돌연변이 유전자(sool-1)를 분리하여 돌연변이 부위의 염기서열을 결정하고 그 특성을 분석하였다. cool-1 유전자의 염기서열 분석 결과, 681번의 염기인 G가 A로 치환되어 Soolp의 $Gly^{227}$이 Asp로 치환되는 결과를 나타내는 것으로 판명되었고, cool-1 유전자는 기존에 보고된 retl-1 유전자와 동일한 돌연변이 유전자로 판명되었다. 그러나, ret1-1이 나타내는 온도감수성 형질은 배지에 1.2 M sorbitol 등의 삼투안정제를 첨가하면 극복될 수 있으며, cool-l/retl-1의 돌연변이 부위가 세포벽합성 관련 단백질의 번역 후 수식과정에 영향을 미친 것임을 확인하였다. 한편, Soolp/$\alpha$-COP의 N-말단에 존재하는 6개의 WD40 domain중 5번째 WD40 domain이 효모의 세포벽 합성이나 구조유지에 중요한 역할을 담당할 것임을 시사하는 결과를 얻었다.
효모 유전자 운반체의 유형을 특징지우는 ARS1 (autonomous replicating sequence), CEN3 (centromere), 2 $\mu$m OR (yeast plasmid의 origin of replication)의 DNA 절편을 재조합하여 만든 유전자 운반체들의 형질전환력, 안정도 및 운반체 수를 효모균주 SHY4(cir$^+$)와 NNY1(cir$^{\circ}$)에서 비교 조사하였다. CEN3를 갖는 유전자 운반체는 매우 안정하나 세포당 수가 하나로 매우 낮으며 2 $\mu$m OR과 ARS1 을 동시에 갖는 유전자 운반체는 안정할 뿐만 아니라 세포당 수도 높으며 균주내에 존재하는 2 $\mu$m 플라스미드는 2 $\mu$m OR을 가지는 유전자 운반체의 복제에 영향을 준다는 사실을 알 수 있었다.
효모를 이용한 에탄올 발효에서 세포 농도가 130g/L일 때 배양액은 약간의 가소성 유체의 성질을 보이며 세포 농도가 증가할수록 cell floc의 형성으로 인하여 세포 분리를 위한 막의 투과 성능은 향상되었다. 세포재순환 에탄올 발효에서 최적 세포농도를 발효액의 유변학적 성질, 막의 투과 성능, 그리고 에탄올 생산성을 고려하여 결정하였다. 또한 최적의 세포 농도에서 최대 에탄올 생산성과 최대 포도당 전환율을 위한 희석 속도를 최적화하였다. 최적의 세포 농도는 130g/L이었고 이 농도에서 최적의 희석 속도는 $1.3h^{-1}$이었다.
핵산 함량이 높은 변이주 Saccharomyces cerevisiae B24를 산업적으로 활용하기 위해 배양 후 자기소화 혹은 효소 분해법으로 효모 추출물을 제조하였다. 배양액의 균체 농도를 10% (w/w)로 하고 pH 5.0, $50^{\circ}C$에서 서서히 교반하면서 48시간 자기소화시켰을 때 세포 내용물이 효모 추출물로 이전되는 수율은 65% 정도였으나 리보핵산은 정미력이 없는 다른 성분으로 분해되어 정미성 핵산성분인 5'-IMP나 5'-GMP가 거의 검출되지 않았다. 반면 $90^{\circ}C$ 이상의 온도로 B24 배양액 1 L를 열처리하여 핵산 분해 효소를 불활성화시키고 세포벽을 변성시킨 다음 ${\beta}-1,3-glucanase$, phosphodiesterase, adenylic deaminase, protease 등을 순차적으로 작용시켜 정미성 5'-IMP와 5'-GMP가 총 3.2% 함유된 효모 추출물(고형분 함량 70%) 84 g을 얻을 수 있었고 이 때 추출물 수득율은 고형분 기준으로 85% 이었다. 반면 모균주인 S. cerevisiae ATCC 7754를 효소적으로 분해할 때 정미성 5'-IMP와 5'-GMP가 총 2.2% 함유된 효모 추출물(고형분 함량 70%)을 77 g밖에 얻지 못하였다.
방선균(Streptomyces) 포자와 효모(Saccharomyces) 반수체 및 배수체 세포를 대상으로 전기충격(AC 38V/1.3 cm)이 화학적 돌연변이원인 N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine(NTG)의 세포치사효과와 돌연변이 유발에 미치는 영향을 조사하였다. 방선균의 경우 전기충격 단독 처리로는 180분 처리하였을 때 생존율이 100%이었으나 960분 처리한 경우에는 모두 사멸하였다. 전기충격과 NTG처리를 병행한 바 방성균의 경우 180분 처리시, NTG 단독 처리시보다 생존율이 72%에서 48%로 감소되었고, 반수체 효모의 경우 40분 처리시 8%에서 3%로, 배수체 효모의 경우 25%에서 10%로 각각 감소되었다. 전기충격과 NTG에 의한 영양요구 돌연변이 형성율에 있어서는 전기충격이 NTG에 의한 돌연변이율을 120분 처리 후 1.8%에서, 13.6%로, 반수체효모의 경우 40분 처리후 2.4%에서 4.8%로 각각 증가시켰다.
본 연구에서는 아직까지 우리나라 미생물관련 학술지에 보고되어 있지 않은 Rhodosporidium diobovatum SY4-2, Cryptococcus bestiolae SY7-1, Kazachstania unispora SY14-1, Kazachstania servazzii SY14-3, Pichia holstii SY20-2와 Cryptococcus tephrensis SY26-1 등 6종의 새로운 국내 미기록 효모들을 전라북도 고군산열도의 선유도 일대 야생화들에서 분리, 동정된 61균주에서 선별하였다. 이들 균주들 모두 구형과 난형으로 50% 포도당을 함유한 YPD 배지에서 잘 생육하였고, Pichia holstii SY20-2는 20% NaCl을 함유한 YPD 배지에서 생육하는 극도 호염성 효모이었다. Cryptococcus tephrensis SY26-1은 포도당을 자화시키지 못하였으나 Cryptococcus bestiolae SY7-1과 함께 유당을 자화시켰다. 6종의 미기록 효모 균주들의 생리기능성을 조사한 결과 이들 균주들의 무세포추출물들의 항당뇨성 ${\alpha}$-glucosidase 저해활성이 86.8-98.6%로 매우 높았고, 특히 Kazachstania servazzii SY14-3의 무세포추출물이 98.6%로 가장 높았다. 또한, 미기록 효모 균주들의 배양상등액의 항고혈압성 안지오텐신 전환효소 저해활성도 58.6-80.4%로 비교적 높았다.
금속결합 단백질인 metallothionein (MT) 유전자 의 발현이 효모의 중금속 내성과 제거 특성에 미치는 영향을 살펴보았다 MT유전자로 형질전환된 재조합 효모는 숙주세포에 비해서 $Cu^{2+}$내성이 3배 이상 증가하였으나, $Cr^{2+}, Pb^{2+}, Znr^{2+}$에 대한 내성은 숙주세포와 별차이가 없었다. 재조합효모는 8mM $CuSP_4$를 함유하며 포도당을 탄소원으로 한 배지에서 18.9mg $Cu^{2+}$/g dry cell로 $Cu^{2+}$를 제거하였다. $Cu^{2+} 와 Zn^{2+}$의 훈합배지에서 $Cu^{2+}$가 존재함으로써 $Zn^{2+}$이 효모에 미치는 독성을 완하시켜 효모의 생육 속도와 최종균체농도를 증가시켰다. 재조합효모의 $Cu^{2+}$ 제거량은 배지중 $Cu^{2+}$농도에 비례하였다. $Cu^{2+}$ 농도가 2배, 3배 증가할 때 균체 g당 $Cu^{2+}$제거량은 각각 2.3배, 3.1배 증가하였다. 그러나 $Cu^{2+}$제거효 율은 $Cu^{2+}$농도와 무관하게 거의 얼정한 값인 57% 를 보였다. $Zn^{2+}$제거량은 $Zn^{2+}$농도에 비례하나 증가율은 $Cu^{2+}$간에 비하여 매우 낮았다.
본 연구에서는 세포외 $\beta$-glucosidase를 생산하는 효모 37개 균주와 Lactobacillus 젖산균 5개 균주 중에서 세포외 $\beta$-glucosidase 효소활성이 우수한 Lactobacillus zeae와 Pichia pijperi을 선발하였고, 2-MBQ와 2,6-DMBQ 생산을 위한 밀배아 발효의 스타터로 사용하였다. P. pijperi 균주만을 이용하여 밀배아를 발효한 경우 2-MBQ는 거의 생성되지 않았으며, 2,6-DMBQ는 발효 개시 후 36시간과 48시간이 경과한 후 각각 $0.02{\pm}0.01$ mg/g 및 $0.02{\pm}0.001$ mg/g의 농도로 생성되었고 Lb. zeae 균주만을 이용하여 밀배아를 발효한 경우에는 발효개시 후 36시간과 48시간이 경과한 후 2-MBQ는 $0.21{\pm}0.02$ mg/g에서 $0.28{\pm}0.06$ mg/g으로 증가하였고 2,6-DMBQ 생성량의 유의적인 차이는 없었다. 효모와 젖산균을 동시에 사용하여 밀배아를 발효했을 때에는 발효 개시 후 36시간이 경과한 후 2,6-DMBQ의 생성량은 효모 및 젖산균을 단독으로 사용한 경우와 비교하여 유의적인 차이를 나타내지 않았지만 2-MBQ의 농도는 0.39${\pm}$0.06 mg/g을 나타내었으며 발효 48시간이 경과하면 더욱 증가하여 0.46${\pm}$0.07 mg/g을 나타내었다. 이러한 결과는 젖산균인 Lb. zeae 균주가 효모인 P. pjperi보다 상대적으로 2-MBQ 및 2,6-DMBQ를 생산하는데 중요한 역할을 하며, 두 균주를 동시에 사용하면 각 균주를 단독으로 사용한 경우와 비교하여 2-MBQ 및 2,6-DMBQ를 생산하는데 상승효과가 있음을 알 수 있었다.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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