• Journal of Applied Biological Chemistry
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• 제64권1호
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• pp.39-48
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• 2021

가뭄은 작물의 성장과 생산성을 방해하는 비 생물학적 스트레스 중 하나다. 비 생물학적 스트레스에 대응하기 위해서는 식물이 불리한 환경 조건에서 스트레스에 나타내는 분자 조절 네트워크를 이해해야 한다. 비 생물학적 스트레스 (가뭄에 대응)에 대처할 수 있는 조합을 선별하기 위한 실험에서 스트레스 조건에서만 발현되는 5개의 가뭄 스트레스 유도성 프로모터를 선별하였으며, 이 중 36개의 cis-regulatory element를 선별하였다. 그 결과 가뭄 스트레스에서만 발현되는 유전자의 프로모터에서 cis-regulatory element를 새롭게 조합하여 미세 제어 조절을 할 수 있는 2 개의 합성프로모터(BL1, BL2)를 제작하였다. 합성프로모터를 포함한 형질전환식물(BL1-GUS, BL2-GUS)의 분석은 합성프로모터가 건조 조건에서 형질전환식물 내의 GUS 유전자의 발현을 증가시키는 것을 통하여 확인하였다. 또한 Transient activation assay를 통해 DREB1A와 DREB2C에 의해 합성프로모터가 활성화되는 것도 확인하였다. 이러한 결과는 가뭄 특이적인 cis-regulatory element의 조합에 의해 제작한 합성프로모터가 다양한 비 생물학적 스트레스에 반응하고, 식물의 성장 지연을 유발하지 않고 스트레스에 효과적으로 대응할 수 있을 것이라 예상할 수 있다.

• 한국미생물·생명공학회지
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• 제36권4호
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• pp.260-267
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• 2008

단백질의 산업적 생산을 위해 발현벡터의 선정이 중요하지만 이용 가능한 프로모터가 극히 제한적이며 많은 경우 과발현되는 특성과 함께 불용성 응집체가 형성되는 단점을 지닌다. 따라서 다양한 생물로부터 유래된 잠재성이 큰 유전자원(metagenome)에서의 프로모터 발굴과 한정된 숙주를 해결하려는 노력이 요구된다. 선행연구에서 발굴한 metagenome 유래의 항시발현 프로모터를 이용해 대장균의 일반적인 배양조건에서 세포생리에 영향이 적은 신규 항시발현 벡터를 제작하였다. 이를 위해 예측된 프로모터 서열과 MCS를 포함하는 합성 primer를 제작한 후 PCR로 증폭해 발현벡터를 구성한 후, 프로모터 구동여부와 단백질 발현양상 등을 관찰하였다. 인위적으로 도입된 MCS에 GFP, esterase, $\beta$-glucosidase를 클로닝해 단백질 발현양과 가용성을 분석한 결과, 안정적으로 전체단백질의 $2{\sim}3%$ 정도로 발현되며 80% 이상의 높은 가용성을 지닌 단백질의 발현이 유도되는 것으로 확인되었다. 이와 같은 결과는 잠재적인 생물자원의 보고로서 metagenome의 활용가능성을 제시하고 있다. 따라서 다양한 숙주에서 작동하는 프로모터의 발굴 및 발현벡터의 제작을 시도할 경우 단백질의 생산이나 대사공학에 의한 균주개량에 유용하게 활용할 수 있을 것이다.

• 미생물학회지
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• 제52권3호
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• pp.249-253
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• 2016

먹물버섯의 하나인 Coprinellus congregatus는 생활사 동안 여러 종의 laccase 효소를 생성한다. 균사 끝 효소와 버섯시원체 효소 및 sclerotium (균핵) 효소들은 모두 이 균의 분화와 관련되었다. 이핵체 균사를 산성 액체배지(pH 4.0-4.5)에 접종하면 새로운 laccase가 합성되어 분비된다. 이 laccase 유전자의 프로모터의 어느 부분이 산 충격의 신호에 관련된 단백질이 결합하는가 분석하기 위하여 녹색형광단백질(green fluorescent protein, GFP) 유전자를 laccase 프로모터 2.0 kb 다음에 연결하고, 이를 형질전환 벡터인 pBARGEM7-1에 삽입함으로써 발현벡터를 구축하였다. 이 promoter-GFP 조합의 5'-region부터 차례로 제거한 짧은 길이의 이 발현벡터를 먹물버섯 교배형 a1균과 a2균에 형질전환 방법으로 도입시키고 phosphinothricin 저항성으로 형질전환체들을 선발하였다. 선발된 형질전환체 a1 (a1TF)과 a2 (a2TF)를 서로 교배하여 동형접합(homozygotic) 이핵체 형질전환체를 만들었다. 이들을 산성 액체배지에서 36시간 배양하고 균체를 모아 confocal microscope를 사용하여 형광을 분석하였다. Laccase 유전자의 전체 프로모터(2.0 kb)를 가진 발현벡터(F0-GFP)를 도입한 동형접합 형질전환체에서는 형광을 보였으나, 그 보다 짧은 길이(1.29 kb 이하)의 프로모터를 가진 형질전환체에서는 형광이 나타나지 않았다. 이 결과에 근거하여 먹물버섯의 산 충격에 대한 신호를 받는 부위가 laccase 유전자 프로모터의 -2.0 kb ~ -1.29 kb 사이에 있을 것으로 추정한다.

• 한국미생물·생명공학회지
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• 제19권3호
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• pp.228-234
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• 1991

DNA 자동합성기를 이용하여 오릴고뉴클레오타이드들을 합성하였으며 이로부터 인간 인터루킨-2를 코드하는 유전자를 제조하였다. 합성 유전자의 염기서열은 대장균에서 사용빈도가 높은 코돈을 고려하여 결정하였으며, 이때 인터루킨-2의 아미노산 서열은 변화시키지 않았다. 합성된 유전자는 람다 피엘 프로모터를 사용하여 대장균에서 발현시켰다. 인터루킨-2는 대장균에서 불용성의 침전물로 생성되었다. 생성된 인터루킨-2는 인터루킨-2 요구 배양세포주의 성장을 촉진하였다.

• KSBB Journal
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• 제13권1호
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• pp.96-100
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• 1998

두 개의 프로모터 (trc와 Pp)를 Alcaligenes eutrophus에서 유래된 PHA 오페론에 삽입하여 재조합 대장균에서 분자량이 큰 polyhydroxybutyrate (PHB)를 얻고자 하였다. 두 개의 프로모터는 hydroxybutyric CoA와 PHA 중합반응의 유전자 발현을 각각 독립적으로 제어하기 위해 설계된 것이다 새로운 합성오페론을 포함한 플라즈미드는 E. coli DH5 $\alpha$ 에 transformation 되어 PHB 생산에 이용되었다. 본 실험의 가설로서 PHA 합성오페론의 IPTG에 의한 유도가 없을 경우 낮은 pHA synthase의 활성이 고분자 중합반응의 개시제 농도를 줄여주어 결과적으로 높은 연결수의 고분자를 생성할 것이라는 모델을 세웠다. 실제로 IPTG의 공급이 없는 발효실험을 통해 평균분자량이 $2.5{\times}10^7$ 인 거대 고분자를 얻을 수 있었다. PHA 생합성에 관여는 효소의 활성 분석으로 3-hydroxybutyric CoA의 중합을 촉매하는 효소인 PHA synthase의 활성을 가지고 In vivo에서 분자량이 제어됨을 확인하였다.

• 대한화장품학회지
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• 제30권3호
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• pp.389-392
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• 2004

본 연구에서 프로모터-리포터 분석방법을 통해 인슐린 유사 성장인자-1의 프로모터를 자극하는 천연물을 선별한 결과 사인 추출물이 가장 좋은 프로모터 자극효과를 나타냈으며, 무모생쥐에서 패쇄첩포 후 RT-PCR로 실험한 결과 IGF-1 mRNA를 $35\%$ 증가시키는 것으로 나타났다. 사인 추출물의 피부 주름개선 효과를 알아보기 위하여 인체 섬유아세포에서는 type-I collagen과 MMP-1 합성 변화를 관찰하였으며, 무모생쥐에서는 콜라젠의 증가와 진피 두께를 관찰하였다. 그 결과, 동위원소를 이용한 콜라젠 증가실험에서 type-I collagen은 $38\%$ 증가하였으며 무모생쥐에서 실시한 RT-PCR 결과에서는 mRNA가 $21\%$ 증가하는 것으로 관찰되었다. MMP-1 효소발현의 경우 ELISA 분석을 통해서 $63\%$의 높은 발현저해능을 확인하였고 Western blot에서도 발현이 저해되는 것을 확인하였다 추출물을 무모생쥐에 패쇄첩포 하였을 경우 대조군에 비해 진피 두께가 두꺼워지고 콜라젠 양도 증가되는 것으로 조직염색 관찰을 통해 확인하였다. 이상의 결과를 통해 사인추출물은 피부 주름개선에 좋은 효과를 나타내는 것으로 보이며, 여기에는 인슐린 유사성장 인자-I의 발현증가와 관련된 기전이 관여하는 것으로 판단된다.

• 한국미생물·생명공학회지
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• 제35권4호
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• pp.272-277
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• 2007

P. pastoris는 대장균에 비해 정확한 접힘, 당화, 효율적인 분비기작등의 장점을 가지고 있어 재조합 단백질의 생산을 위한 균주로서 관심을 받고 있다. 또한 재조합 단백질의 효율적인 생산공정 개발을 위하여 배양공정 중 특정 시간이나 조건에서 발현될 수 있는 효율적인 유도성 프로모터의 개발도 중요 관심 분야이다. 본 연구에서는 연속배양을 이용하여 P. pastoris의 배양 중 특정 기질이 소모되었을 때 발현되는 자동 유도성 프로모터를 개발하기 위하여, 인산이 고갈되었을 때 과발현 되는 유전자들을 탐색하였다. 인산 제한 연속배양의 정상상태에서 얻어진 균체로 부터 total RNA와 mRNA를 분리하였고, 이로부터 cDN를 합성하여 인산제한조건에서 과발현되는 유전자들을 확보하였다. 그 중 빈도수가 높은 8종의 유전자 3-phosphoglycerate kinase, glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase(GAPDH), glucokinase, thiol-specific antioxidant protein, triosephosphate isomerase, sodium/phosphate symporter(NPS) 그리고 pyruvate decarboxylase를 선별하였고, Northern blot analysis를 수행한 결과 인산 섭취에 관련된 NPS 유전자가 인산제한조건에서 과발현 됨을 확인하였다. 본 연구실에서는 자동유도성 프로모터로서 NPS유래의 프로모터의 잠재성을 알아보기 위하여, 관련 유전자를 확보하여 외래 유전자를 이용한 발현연구를 진행 중이다.

• 생명과학회지
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• 제26권1호
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• pp.140-145
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• 2016

다세포 생물의 유전자들은 발생 및 분화 그리고 조직 특이적으로 전사되며, 이러한 유전자 전사는 게놈 상에서 멀리 떨어져 존재하는 인핸서(enhancer) 부위에 의해 조절된다. 최근의 연구들은 활성화된 인핸서에서 RNA Polymerase II (Pol II)에 의해 noncoding RNA가 전사된다고 보고하고 있으며, 이들은 인핸서 RNA (eRNA)라 불리고 있다. eRNA는 인핸서 중심으로부터 양방향으로 합성되며, 5’ capping은 일어나지만, splicing이나 3’ tailing은 되지 않는다. eRNA의 전사는 전사 활성자의 결합에 의해 일어나며, 표적 유전자의 전사 수준과 비례하게 일어난다. 인위적으로 eRNA의 전사를 억제하거나 합성된 eRNA를 제거하면 표적 유전자의 전사는 억제된다. eRNA의 전사 과정은 인핸서 부분의 활성 히스톤 변형을 유도하며, 합성된 eRNA는 인핸서와 프로모터 사이의 크로마틴 고리 구조 형성을 매개한다. 또한 표적 유전자의 프로모터에 RNA Pol II를 모집하고 이들의 신장을 촉진하는 것도 eRNA의 역할로 보인다. 본 총설은 인핸서 유래 eRNA의 특징에 대해 살펴보고, eRNA의 합성 기작 및 표적 유전자의 전사 조절을 위한 eRNA의 역할을 정리해보고자 한다.

• 한국미생물·생명공학회지
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• 제15권6호
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• pp.396-401
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• 1987

$\beta$-Galactosidase 유전자 조작된 두 대장균 숙주-벡터 시스템의 단백질 생산가 배양특성을 비교하였다. Tac 프로모터를 갖는 Escherichia coli JM109/ pTBG10 균주가 pL 프로모터를 갖는 E. coli MH 3000(pRKcI857)/ pASl(lacz) 균주보다도 단백질 생산성에 있어서 훨씬 우수하였으며 초기 및 중간 대수 증식기에서의 발현 유도가 단백질 생산에 있어서 유리함을 관찰하였다. 또한 유전자 발현시기에 있어서는 산소요구량이 매우 높았으나 pH를 일정하게 조절함에 의해 산소요구량을 어느 정도 낮출 수 있었고 생산성도 향상됨을 관찰할 수 있었다. 고생산성 균주(E. coli JM109/pTBG10)의 경우 플라스미드 함유 균체의 플라스미드 상실 균체에 대한 비증식속도의 비 $\mu$ + /$\mu$- 가 저생산성 균주보다도 낮았으며 이것은 유전자발현에 따른 단백질 합성부담이 매우 큰 때문으로 판단되었다. 또 플라스미드 안정성을 30세대까지 추적하였는바 유전자 발현 조건하에서 두 균주 모두 25세대 후 10% 정도의 안정성을 보였으나 E. coli JM109/pTBG10 균주의 안정성이 상대적으로 우수하다고 판단되었다.

• Journal of Plant Biotechnology
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• 제45권4호
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• pp.364-368
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• 2018

R2R3 유형의 단백질인 IbMYB1 전사인자는 고구마의 뿌리에서 안토시아닌 생합성 과정을 조절하는 중요한 단백질이다. 선행연구에서 IbMYB1 유전자의 발현 증가를 통한 안토시아닌의 합성 증가가 담배, 애기장대 및 고구마의 저장뿌리에서 증명된 바 있다. 본 연구에서는 괴경(저장줄기) 특이적 PATATIN 프로모터와 산화스트레스 유도성 SWPA2 프로모터의 조절하에서 안토시아닌을 고함유하는 IbMYB1 유전자 과발현 형질전환 감자를 개발하여 그 특성을 분석하였다. PAT-IbMYB1 형질전환 식물체들은 대조구 식물체 및 SWPA2-IbMYB1 식물체 보다 높은 안토시아닌 함량을 괴경에서 나타내었다. 본 연구의 결과로서, IbMYB1의 과발현은 형질전환 기술을 이용한 특정 조직 특이적 안토시아닌 생산에 매우 좋은 개발 기술이 될 것으로 생각되는 바이다.