메기(Silurus asotus)의 껍질로부터 항균성 펩타이드를 정제하였다. 메기 껍질의 산 추출물은 단계적 농도구배조건으로 Sep-Pak C18에 의해 부분적으로 정제되었으며, 그 중에서 특히 60% 메탄올 분획(RM60)이 Escherichia coli D31에 대해 가장 좋은 항균활성을 나타내었다. 이 RM60을 사용하여 이온교환 및 5단계의 연속적인 역상 HPLC로 정제하였다. 정제된 펩타이드의 분자량과 아미노산 서열분석은 MALDI-TOF MS와 에드만 분해법으로 분석하였다. 이 펩타이드의 분자량은 약 4182.1 [M+H]+이었으며, 분석된 이 물질의 부분적인 일차구조서열은 다음과 같다; PALXXKARREAKVKF. 이러한 결과는 메기의 껍질에서 존재하는 이 펩타이드가 메기의 껍질에서 반응하는 선천성 방어 시스템에서 중요한 역할을 하고 있다고 여겨진다.
실크 피브로인의 가수분해를 통해 생산된 펩타이드 성분에 의해 murine macrophage RAW264.7 세포에 의한 nitric oxide 생성이 촉진됨을 발견하였다. 산 및 효소적 가수분해물의 가수분해도를 비교한 결과 실크 피브로인 단백질은 산 가수분해에 의해 가장 효과적으로 분해되었으며 효소적 가수분해의 경우에는 pepsin, trypsin, Alcalase의 순으로 가수분해도가 높았다. 산 가수분해물을 단독으로 macrophage에 처리하였을 때 처리농도에 따라 NO 생성촉진활성이 높아졌으나 이 활성은 가수분해물 내의 펩타이드 성분들과 오염되어 혼재하는 LPS 성분의 상호작용에 의한 것임이 확인되었다. 함유된 LPS 성분들을 한외여과에 의해 제거한 효소적 가수분해물들의 NO 생성촉진활성은 peptic hydrolysate가 가장 높았고 tryptic-, Alcalase hydrolysate 순이었다. 이러한 활성의 차이는 가수분해물 내의 고분자량 펩타이드 분포가 많을수록 활성이 높다는 관계에 기인하였으나 산 가수분해물의 경우에는 예외적으로 나타났다. 각 가수분해물의 아미노산 조성을 분석한 결과 arginine, lysine의 함량이 높을수록 활성이 높으며 alanine의 glycine에 대한 비율이 커질수록 활성이 높아졌다. 산 가수분해물의 경우에는 낮은 분자량의 펩타이드들이 많이 분포하지만 arginine 및 alanine의 함량이 높아 비교적 높은 NO 생성 촉진활성을 나타내는 것으로 확인되었다.
가금류 중에서 연산오계는 예로부터 다양한 효능 지닌 건강기능식품으로 알려져 있다. 최근 육질 단백질로부터 유래한 기능성 펩타이드에 대한 연구가 활발하게 진행 되어 본 연구는 오계 다리육으로부터 표면 반응 분석을 이용하여 최적 공정을 수행하였다. 상업용 단백질 가수분해 효소 bromelain 1200을 이용하여 오계 다리육 단백질로부터 펩타이드 분자량을 가지는 단백질 가수 분해물 최적 제조 공정 조건을 표면반응 분석법을 이용하여 수행을 하였다. 제조 공정 변수들은 범위는 압력(30-100 MPa), 반응시간(1-3시간), 반응 기질 양(10-30%) 이었다. 가수분해도 최적 조건은 압력은 높을수록 증가를 하였고, 반응 시간은 시간은 3시간, 기질의 농도는 20%에서 결정이 되었다. 이때 최대 가수분해도가 34.10%이였다. 단백질 가수분해물은 대부분 펩타이드의 분자량인 1,000이하의 분자량 분포를 보여 주었다. 펩타이드의 유리 아미노산들의 함량은 leucine, lysine, alanine, glutamic acid, phenylalanine 순으로 존재하였고, 구성아미노산을 제외한 아미노산에서는 taurine(4.9%), ornitine(1.8%), anserine(1.6%), hydroxylysine(1.4%) 등의 순으로 존재하였다.
최근에는 콜라겐 펩타이드가 항상화효과를 통해 피부의 재생을 촉진시키는 효과를 한다는 연구가 보고되고 있다. 본 구는 저분자 경구 콜라겐 펩타이드가 1550 nm fractional photothermolysis 레이저 치료 후 피부재생에 미치는 영향을 알아보고자 한다. 본 실험에 참여한 환자는 총 10명으로 실험군과 대조군 각 5명씩 무작위배정되었다. 대조군과 실험군 모두 동일하게 fractional photothermolysis 레이저를 시술받았다. 실험군에서는 경구 콜라겐 펩타이드를 하루에 1,000 mg씩 총 8주간 복용하였다. 치료 전후 모든 환자에서 피부의 탄성도, 경표피수분손실도, 홍반지수를 측정하였다. 피부탄성도는 실험군에서 대조군에 비해 통계적으로 유의하게 피부의 탄력성이 증가하였음을 확인하였다(p < 0.05). 경표피수분손실도는 두군간에 유의한 차이가 없었고, 홍반지수는 실험군에서 더 빨리 감소하는 결과를 보였다. 환자의 주관적 만족도평가에서 시술 4주 후 환자의 만족도는 실험군에서 평균 2.0점, 대조군에서 1.2점으로 나타났다. 저분자 콜라겐 펩타이드는 1550 nm fractional photothermolysis 레이저 치료 후 피부회복 촉진에 도움이 된다.
최근 급속도로 당뇨병 환자가 증가하면서 인슐린 시장이 크게 성장하고 있다. 또한 최근 식물체를 이용하여 의약용 단백질 생산이 경제적인 측면과 안정성 측면에서 매우 효과적임이 보고되고 있어 이를 이용한 분자농업이 주목을 받고 있다. 본 연구에서는 인슐린 단백질을 식물체에서 생산하기 위한 유전자 발현 construct를 설계하기 위한 실험으로서 식물발현용 preprominiinsulin construct를 제조하기 위한 단계적 실험을 수행하였다. 우선 proinsulin이 무세포 식물 전사/번역시스템에서 성공적으로 발현됨을 확인하였다. Prominiinsulin construct를 제조하여 대장균에서 발현시키는데 성공하였으며, 이를 트립신으로 절단한 후 인간 항인슐린 항체를 이용한 western 분석을 통하여 효과적으로 A-펩타이드와 B-펩타이드가 형성되며 이후 적절하게 접힘이 일어나고 hexamer로 조립됨을 확인하였다. 이후 식물체에서 재조합 인슐린 유전자가 발현되는지를 확인하기 위하여 RFP 결합 construct를 제조하여 담배의 현탁배양세포인 BY-2 세포에 형질전환시켜 RFP 결합 preprominiinsulin이 성공적으로 발현됨을 확인 하였다. 이러한 성공적인 연구 결과를 토대로 향후 이 construct는 RFP 단백질을 제거하여 35S 프로모터에 직접 유도되는 [N 말단 ${\rightarrow}$ tobacco E2 시그널 펩타이드 ${\rightarrow}$ B-펩타이드(1-29 AA) ${\rightarrow}$ AAK ${\rightarrow}$ A-펩타이드(1-21 AA) ${\rightarrow}$ RR ${\rightarrow}$ His6 ${\rightarrow}$ KDEL ${\rightarrow}$ C 말단] construct를 제조하여 담배 식물체에 형질전환시켜 분자농업을 통해 인간 인슐린 단백질을 생산하는데 활용하고자 한다.
최근 염분의 섭취와 관련하여 건강에 대한 우려가 늘어남에 따라, 염미대체제에 대한 소비자들의 관심이 급증하고 있으며, 세계적으로 경쟁력 있는 천연 저염제품의 개발이 필요한 실정이다. 최근 연구를 통해 식물성 및 동물성 원료 배합을 통해 가수분해물을 조제하여 최적 화합물을 얻는 것에 성공하였다. 본 연구에서는 염미성 펩타이드 분말내 arginine을 함유한 염미성 펩타이드를 규명하고 정량 하고자 하였다. L-arginine 또는 arginine을 포함한 펩타이드를 표준물질로 하여 $^{13}C$-NMR로 분석한 결과 유사한 위치에 구아니딘기 탄소가 시그널(L-arginine: 156.8 ppm, Arg-Ala: 156.4 ppm, Arg-Ser: 156.4 ppm)이 나타남을 확인하였고, 이를 통해 간편하고 신속하게 arginine 함유 펩타이드 정량분석이 가능할 것으로 기대된다.
신규 미백 소재 개발을 위하여 tyrosinase의 활성을 억제하는 천연물과, alpha-melanocyte stimulating hormone ($\alpha$-MSH)을 저해하는 펩타이드를 결합한 소재를 고체상 합성법으로 제조하였다[1,2]. Tyrosinase 활성 억제 효능이 있는 천연유래물질을 기존 연구를 바탕으로 선정하였으며, 이중에서 상업화 된 물질 17종에 대해 Mushroom Tyrosinase 활성 억제 효과를 측정하여, 그 중 caffeic acid, coumaric acid를 선별하였다. 펩타이드는 $\alpha$-MSH 분비를 억제하며, tyrosinase활성을 억제하는 것으로 알려진 melanostatin을 선정하였으며[3-5], PLG-$NH_2$ (Proline-Leucine-Glycine-$NH_2$) 중에서 유도체화 수율의 저하 원인으로 예상되는 Proline (Pro)의 서열을 다른 아미노산으로 변경하면서 선별된 천연물인 coumaric acid와 caffeic acid에 도입하였다. 또한 최종물질의 원가를 고려하여 acid-amide 형태를 acid형태로 전환한 유도체를 합성하였다. 이들 펩타이드 유도체들에 대해서 B16F1 melanoma cell에서의 멜라닌 생성 억제 효능을 평가하여 유도체화된 물질이 기존의 천연유래물질이나 펩타이드에 비하여 높은 저해효과를 가지는 것을 확인하였다.
본 연구는 감마선 조사와 실크 펩타이드 병용처리가 세균의 방사선 감수성 및 햄버거 패티의 저장 안전성에 미치는 영향을 평가하기 위해 실시되었다. 멸균된 햄버거 패티에 접종된 4종의 세균에 대한 감마선 $D_{10}$ 값은 E. coli 0.25 kGy, L. ivanovii 0.50 kGy, S. typhimurium 0.55 kGy, C. sporogenes 1.35 kGy 이였다. 실크 펩타이드 5% 첨가 햄버거 패티에 접종된 S. typhimurium의 $D_{10}$ 값은 대조구의 0.558 kGy에서 0.53 kGy로 6% 낮아지는 것으로 나타났다. 한편, $30^{\circ}C$ 가속 저장조건에서 햄버거 패티의 미생물 생육도를 측정한 결과 7 kGy이상의 감마선 조사에 의해 저장기간 동안 미생물이 검출되지 않았으며, 실크 펩타이드 7% 첨가시 대조구에 비해 약 1 log cycle의 미생물 생육 감소를 확인하였다. 따라서 실크 펩타이드 첨가는 방사선 조사와 같이 다른 식품 살균기술과 함께 사용한다면 식품의 초기오염 미생물을 제어하여 저장 안정성을 확보하는데 도움이 되는 것으로 판단되었다.
펩타이드의 정성 분석에서, O-Methylisourea는 펩타이드의 특정 아미노산(예. 라이신)에 화합결합하여 해당 펩타이드의 신호를 증진시키기 때문에 펩타이드를 matrix-assisted laser desorption/ionizationmass spectrometry (MALDI-MS) 분석하기 위해 흔히 사용되는데, 이러한 과정은 guanidination이라고 불린다. Guanidination은 반응 조건에 따라 효율이 변하게 된다. 본 연구에서는 트립신으로 가수분해된 미오글로빈 단백질을 세 가지 다른 반응시약 (O-methylisourea, S-methylisothiourea, 2-methyl-2-imidazoline)을 사용하여 $65^{\circ}C$ 에서 1 시간 동안 다양한 pH 조건 (pH 4.0, 7.0 및 10.5)에서 guanidination 반응을 수행하였는데, 실험 결과 O-methylisourea와 pH 10.5이 가장 좋은 효율을 나타내었다. 다음으로 O-methylisourea와 pH 10.5의 반응 조건을 이용하여 열, 마이크로파, 초음파 등과 같은 다양한 조건에서 시간을 변화시켜 가면서 guanidination을 연구하였는데, 열을 이용하여 60 분 동안 반응시키는 것이 가장 효과적이었다. 결론적으로 O-methylisourea을 이용하여 pH 10.5 용액에서 열을 이용하여 1 시간 동안 $65^{\circ}C$에서 가열하는 것이 guanidination을 위한 최적의 조건이었다.
본 연구에서는 3 개의 아미노산으로 이루어진 트리펩타이드의 미세먼지에 의한 인간각질형성세포의 손상 억제 효과에 대해 확인하였다. 실험 결과 트리펩타이드 처리 시 미세먼지에 의한 세포 사멸이 억제되어 생존율 증가가 관찰되었으며, aryl hydrocarbon receptor (AhR) 기전 활성이 억제 되어 독성 대사체 생성과 염증반응에 관여하는 하위 인자인 cytochrome P450 family 1 subfamily A member 1 (CYP1A1) 및 cyclooxygenase-2 (COX-2)의 발현이 저해되었다. 또한 미세먼지에 의한 산화적 스트레스 억제 효과를 나타내어 염증성 사이토카인의 발현을 저해하였고, 피부 구성 단백질의 분해를 유도하는 matrix metalloproteinase-1 (MMP-1)의 발현을 저해하였으며, 세포 사멸 인자의 수준을 저해하였다. 이 결과를 종합해 볼 때, 본 연구의 트리펩타이드는 미세먼지에 의한 인간각질형성세포의 사멸 및 주변 피부 조직의 손상을 유도할 수 있는 기전들을 억제하여 보호 효과를 나타내는 것으로 보인다. 트리펩타이드의 이러한 안티폴루션 효과는 신규 기능성 화장품 소재로 응용될 수 있을 것으로 기대된다.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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