트립토판 합성효소의 이소조절성에 작용하는 리간드가 알려져 있다. $\beta$반응의 기질인 세린만이 있는 조건에서 일가 양이온과 glycerophosphate의 리간드효과를 잔기치환체를 사용하여 조사하였다. 이들 리간드가 이 효소의 이소조절성에 관여하고 있음을 보여주고 있다.
단백질 덩어리는 질환의 원인이 되기도 하고, 유용한 유전자 재조합 단백질의 생산시 문제를 야기하기도 한다. 본 연구에서는 조건을 달리함으로 트립토판 합성효소 ${\alpha}$ 소단위체로부터 적어도 3가지 이상 다른 종류의 덩어리가 생길 수 있음을 보여주고 있다; (1) 불투명 흰색 침전 가능한 덩어리 (2) 투명하고 겔 유형의 침전 가능한 덩어리 (3) 불침전 덩어리. 이런 다른 종류의 덩어리 형태는 다른 기작을 통해 일어날 것으로 추정된다.
Tryptophanase를 이용하여 트립토판 합성시 인돌의 효소활성 저해를 억제하기 위하여 유가식 조업, 유기용매 이상계의 사용, 그리고 cyclodextrin의 첨가등에 대하여 연구하였다. 효소 농도가 0.5mg/ml일때 인돌 농도 0.4mM 부근에서 트립토판 생성이 가장 빨랐으며 그 이상에서는 효소활성이 심한 저해를 받았다. 초기 인돌 농도가 20mM일 때는 27시간 반응후 인돌의 전환율이 20인데 비하여 반응기내 인돌 농도를 5mM 이하로 유가식 조업을 하였을 때 전환율이 80%로 향상되었다.
저온에서 일어나는 식물생육의 억제와 식물생장조절물질의 하나인 IAA 수준의 조절을 알아보기 위하여 암실재배한 백색 완두유묘를 재료로 저온처리에 따른 생육과 IAA 수준의 변화를 조사하였다. $25^{\circ}C$에서 성장한 백색 완두유묘는 $5^{\circ}C$의 저온에 접하면 생장이 거의 정지하였다. 유리 IAA 수준은 생체중 기준 상온묘의 17.6 ng/g에서 3일간 저온처리시에 4.9 ng/g으로, 총 IAA 수준은 113.2 ng/g에서 60.8 ng/g으로 현저하게 감소하였다. IAA의 전구체인 트립토판 수준은 생체중 기준 상온묘의 583 nmol/g에서 저온처리시에 414 nmol/g으로 약 30 % 감소하였으며, 시킴산경로에 의하여 트립토판과 함께 생합성되는 페닐알라닌과 티로신 수준도 감소하였다. 이 결과는 저온에서 IAA의 전구체인 트립토판 생합성의 억제를 통하여 IAA 수준을 일부 하향조절할 수 있을 것임을 시사한다.
결과적으로 시판 피마자박을 성장하는 병아리 혹은 기타 단위 동물의 단백질 사료로서 이용하기위해서는 다시 제독처리해야함을 알 수 있다. 제독처리 방법 중에서도 끓는 물로 여과하여 독소를 축출하는 방법이 가장 좋고 이 방법이 독소를 전부는 아닐지라도 대부분 제거시키는 방법이다. 피마자박의 아미노산조성을 볼때 그 생물가가 낮은 주요 원인이 라이신 트립토판 그리고 S 함유 아미노산이 부족하기 때문임을 알 수 있다. 제독처리한 피마자박의 라이신과 메치오닌 그리고 트립토판을 첨가하면 대두단백+메치오닌(0.2$\%$) 만큼 병아리성장에 유효함을 알 수 있다. 다른 필수 아미노산의 첨가는 별 효과가 없고 어분 대두단백 혹은 난백의 첨가도 부족한 아미노산을 첨가해 주는 것만큼 효과적이 아니었다. 라이신이 가장 먼저 부족되는 것이고 다음 트립토판이다. 메치오닌은 NRC 권장량의 60$\%$ 밖에 안되나 실제로 피마자박에 적절히 함유한다. 이것은 NRC 권장량이 너무 높다는 스콧트와 그의 동료의 주장과 일치하고 있다. 체중변화를 볼 때 흥미있는 것은 피마자박에 어분을 첨가하면 각 그룹간 병아리 체중의 차이가 심한데 어분대신 아미노산을 첨가하면 그 차이가 현저히 감소한다. (25$\%$와 15$\%$) 이러한 현상은 아미노산이 부족한 사료를 먹으면 성장에 필요한 아미노산 요구량이 개체별로 차이가 있기 때문일 것이다. 피마자박에 아미노산을 첨가하면 단백질 최종이용율이 현저히 증가하나, 이정도는 대두단백+메치오닌(0.2$\%$)에 비하면 이용율이 낮은데 그 이유는 아마 피마자박중의 리그닌과 조섬유 함량이 높기 때문일 것이다. 피마자박의 사료는(사료중 40$\%$) 조섬유가 약 15$\%$나 되어 이것 때문에 사료 섭취량이 대두단백사료 보다 증가하게 되고 사료섭취량이 많으면 단백질 섭취도 많게 되어 피마자박의 단백질 이용율이 낮게 된다. 즉 최종 단백질 이용율은 단백질 섭취량과 역비례한다. 만약 피마자박의 조섬유를 일부 혹은 전부 제거하기만 한다면 양계및 기타 단위 동물의 단백질 사료 자원으로서 그 가치가 훨씬 높아질 것이다. 더욱 희망적인 것은 피마자박 생산자측에 의하면 피마자씨 껍질의 상당한 부분을 제거하는 것은 가능하다고 한다.
루신-반응 조절 단백질(Lrp)은 18.8 kDa의 분자량을 갖는 164개의 아미노산으로 이루어진 글로벌 조절 단백질으로서, 야생형의 단백질(Lrp Wt)에는 아미노산 중 가장 강한 자체 형광을 띠는 트립토판이 존재하지 않는다. Lrp 단백질의 구조변이에 대한 정보를 줄 수 있는 형광분석을 위하여 Lrp Wt과 트립토판이루신-반응 영역에 단지 하나 존재하는 돌연변이 단백질(Lrp R145W)을 분리 정제하였다. Lrp R145W 단백질은 이들 ilvIH 오페론에서 고안된 Lrp 결합 특정 DNA와 아미노산 루신과의 결합 후에 형광이 감소하였으며 acrylamide, urea 등에 의해서도 급격히 쇄광하는 양상을 보였다. 이들 형광 실험 결과는 Lrp의 3차원적 구조 및 배향을 연구에 중요한 정보를 제공하여 줄 수 있을 것이다.
유전자 조작된 Klebsiella pnuemonia를 이용하여 트립토판 생산을 위한 최적 조건 및 플라스미드 안정성에 대한 연구를 수행하였으며, 최적온도는 $37^{\circ}C$, 최적온도에서의 비증식속도는 1.05$h^{-1}$로 측정되었다. 포도당을 기질로 사용하여 첨가회분배양 36시간 후의 트립토판 농도는 0.175g/l 이었으며, 이 결과는 다른 회분배양이나 플라스크 배양에 비해 1.2 및 1.6배 증가한 수치이다. 첨가회분배양에서의 균주안정성은 플라스크에서의 연속 교대 배양에서는 95%가 유지되었으나 첨가 회분배양에서는 50%만이 유지됨을 측정했다.
대장균 트립토판 합성효소의 $\beta$반응의 빠른 속도 반응에 일가 양이온의 영향을 D56N과 D56G 잔기치환체를 대상으로 조사하였다. 일가 양이온을 처리하였을 때 생성되는 중간반응 생성물의 생성과 분해 속도가 영향을 받았다. 56번 자리 잔기치환체도 야생형에 비해 반응의 중간산물의 생성과 분해에 있어 모두 느린 속도를 보여주고 있다. 이들 잔기 치환체에 미치는 일가 양이온의 영향 또한 달라졌다. 이 결과는 대장균의 효소에서도 56번잔기가 이소조절에 관여하고 있고, 이 과정에서 일가 양이온들이 이소조절 리간드역할을 수행하는 것을 보여준다.
Two-photon microscopy (TPM) is minimally-invasive 3D fluorescence microscopy based on nonlinear excitation, and TPM can visualize cellular structures based on auto-fluorescence. Line-scanning TPM is one of high-speed TPM methods without sacrificing the image resolution by using spatial and temporal focusing. In this paper, we developed line-scanning TPM based on spatial and temporal focusing for auto-fluorescence imaging by exciting the tryptophan. Laser source for this system was an optical parametric oscillator (OPO) and it made near 570 nm femtosecond pulse laser. It had 200fs pulse width and 1.72 nm bandwidth, so that the achievable depth resolution was 2.41um and field of view (FOV) is 10.8um. From the characterization, our system has 3.0 um depth resolution and 12.3 um FOV. We visualized fixed leukocyte cell sample and compared with point scanning system.
최근에 발표된 연구 결과에 의하면 대장균 트립토판 중합효소(tryptophan synthase) $\alpha$ 소단위체에서 33번 잔기의 세린과 112번 잔기의 아스팔산은 이 효소의 구조 형성 과정(folding)에 관여하는 것으로 보여진다. 이들 효소를 대장균내에서 과발현시켰을 때, SL33(잔기 33번의 세린이 류신으로 치환) 효소는 대부분 웅집된 덩어리형태의 효소로 생성되고, DG112(잔기 112번의 아스팔산이 글리신으로 치환) 효소와 DN112(아스랄산이 아스파라진으로 치환) 효소는 야생형 효소와 비슷한 양의 수용성형태로 생성된다고 보고된 바 있다. 본 연구에서는 이 효소의 구조 형성 과정동안 33번 잔기와 112번 잔기가 상호 작용하는 가를 조사하기 위하여 주 자리 잔기 치환 단백질을 만들어 이들의 성질을 단일 잔기 치환 단백질들과 비교하였다. 이들을 대장균내에서 젖당으로 과생산하여 전기영동으로 조사하여 본 결과 SL33 단일 잔기 치환 효소에 비해 SL33/DG112 이중 치환 효소는 현격히 보다 많은 양이 응집된 형태의 불용성 효소로 생성 되며, SL33/DN112효소는 많은 양의 효소들이 가용성 효소로 생성되었다. Densitometer로 정량한 결과 SL33/DN112 치환 소단위체는 SL33 치환 소단위체에 비해 가용성 형태의 양에 대한 응집된 형태의 양의 비가 6시간 젖당처리시 약 5배, 22시간 젖당처리시 약 13배 증가하였으며, SL33/DN112 치환 $\alpha$ 소단위체는 그 비가 1/4-1/3로 감소했다. 이러한 결과는 331번 위치에서 세린이 류신으로 치환되었을 때 나타나는 구조 형성 과정의 변화를 112번 위치에 새로 치환된 글리신 또는 아스파라진이 영향을 미쳐, 구조 형성 솨정 변화가 더욱 더 변화했거나 원상태로 어느 정도 회복되었음을 의미한다. 이 결과는 대장균 트립토판 중합효소 $\alpha$ 소단위체의 N 말단 도메인(N-terminal domain)의 구조 형성 과정시 33번 잔기와 112번 잔기가 상호작용을 하고 있음을 시사해 주고 있다.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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