본 연구는 인공수정 센터에서 이용되고 있는 종모돈의 인공수정 분만율의 차이를 기준으로 하여 정액의 보존 일에 따른 정자의 생존율, CASA, HOST, IVP 및 SCSA를 조사하여 이들 정자의 분석법들과 인공수정 분만율과의 상관관계를 조사하여 종모돈의 수정 능력을 예측할 수 있는 정액 평가법을 개발하고자 실시하였다. 종모돈의 액상정액을 대상으로 CASA, HOST, IVP 및 SCSA 기법을 적용한 정액의 평가 결과는 다음과 같았다. 정액의 보존 일별 HOST 결과는 보존 일이 경과함에 따라 유의적으로 감소하였고(P<0.05), IVP 결과 난자 당 침투 정자 수는 보존 3일째에 유의적으로 감소하였다(P<0.05). 보존 0일과 6일에 HOST는 분만율이 80% 이상인 종모돈 군이 70% 미만인 종모돈 군 보다 유의적으로 높았고, 3일에서는 80% 이상인 종모돈 군이 다른 종모돈 군에 비하여 높았다(P<0.05). IVP는 보존 0일에 분만율이 80% 이상인 종모돈 군이 70% 미만인 종모돈 군보다 난자당 침투 정자 수가 유의적으로 많았다(P<0.05). %Red는 보존 0일과 3일에는 분만율이 80% 이상과 70% 미만인 종모돈 군 간에 유의적인 차이를 보였으나 보존 6일에서는 모든 종모돈 군간에 유의적인 차이가 있었다(P<0.05). %Red(r=0.79, P<0.01 ; r=0.86, P<0.01 ; r=0.88, P<0.01)는 정액의 보존 일이 증가함에 따라 분만율과의 부의 상관 계수가 증가하였다. 이상의 결과를 종합해 보면 SCSA는 정액의 수정 능력을 평가하는데 있어서 매우 유용한 방법이며, 정액의 보존 일은 여러 가지 정자 기능과 SCSA 결과에 크게 영향을 주는 것으로 나타났다. 정액의 수정 능력을 평가함에 있어서 정액의 보존 일령을 고려하고 정자 기능 검사와 SCSA를 병행하여 실시할 경우 종모돈의 수정 능력 평가 시 정확성을 더욱 높일 수 있는 유용한 방법이 될 수 있을 것으로 사료된다.
본 연구는 ICSI후 돼지 난자의 활성화 처리와 ICSI전 주입정자의 수정 능력 획득 유기효과를 구명하기 위하여 실시하였다. ICSI후 ethanol, cycloheximide 그리고 ethanol과 cycloheximide를 병용처리 시 난할율과 배반포배 발달율이 대조구와 처리 구간에 유의적인 차이가 없었다(p<0.05). 그러나 ICSI전 caffeine과 Ca-ionpphre로 주입정자의 수정능력 획득 유기 처리 시 난할율과 배반포배발달율 모두 처리구에서 유의적으로 놓았다(p<0.05). 한편 ICSI후 난자활성화처리 시 전핵형성율과 총 난자 활성화율은 대조구와 처리구간에 유의차가 없었지만(p<0.05) 정자의 수정능력 획득 유기 처리 시 전핵형성율과 총 난자 활성화율은 처리구에서 유의적으로 높게 나타났다(p<0.05).
생쥐 정자의 수정능력획득과 첨체반응에 작용하는 $Na^{+}$/H$^{+}$ antiporter의 역할을 조사하고자 하였다. $Na^{+}$/H$^{+}$ antiporter를 특이적으로 억제하는 dimethyl amiloride는 정자의 자발적인 첨체반응을 농도 의존적으로 억제한 반면 난포액 및 calcium ionophore인 A23l87에 의해 유도된 첨체반응은 억제하지 못하였다. 이러한 결과는 정자내 $Na^{+}$/H$^{+}$ antiporter에 의한 1가이온의 출입과 이에 따른 세포질내 pH 조절이 정자의 수정능력 획득과 자발적인 첨체반응에 조절요인으로 작용함을 암시한다. 수정능력을 획득한 정자에서 난포액 등의 agonist 또는 A23l87에 의해 유도되는 첨체반응은 $Na^{+}$/H$^{+}$ antiporter와는 무관하게 진행되는 것으로 사료된다.
양측성 잠복고환을 가진 18개월 연령의 잉글리쉬 불독에서 고환하강고정술을 실시하였고 수술 1달 후 GnRH를 투여하였다. 수술 전후 정액검사를 실시하였으며 인공수정을 통해 생식능력을 검증하였다. 수술 전과 수술 2달 후 정액검사 결과, 무정자증으로 판단되었으나 수술 4개월 경과 후 6마리의 정자가 관찰되었다. 수술 7개월 후 정자수를 제외한 나머지 정자 소견에서 정상을 나타내었으며 수술 8개월 후 채취된 정액을 암컷 불독에게 인공수정한 결과 6마리의 건강한 산자를 생산하였다. 양측성 잠복고환견에서 성성숙 이후라 할지라도 고환하강고정술과 GnRH 투여를 통해 정자형성과 수정능력이 회복 가능함을 알 수 있었다.
황복(Takifugu obscurus) 정자의 냉동보존을 위한 기초자료를 얻고자, 냉동보존 조건에 관한 연구를 수행하였다. 황복 정자의 냉동보존을 위한 희석액으로는 다른 여러 가지 희석액에 비해 MFRS가 가장 적합하였으며, 동해방지제로는 DMSO가 glycerol에 비해 효과가 좋은 것으로 나타났다. MFRS를 희석액으로 하고 동해방지제인 DMSO를 최종농도가 5%되도록 첨가하여 정자를 냉동보존하였을 때, 해동정자의 수정률은 74.3±7.5%로 가장 보존효과가 좋았다.
자성발생성 2배체 유도 기법과 물리학적 처리 방법에 의해 유도된 자성발생성 2배체 숫컷 넙치의 생식 능력 평가를 위해 2년생 어류를 이용하여 정소의 조직학적 분석, 정자에 대한 세포학적 분석 그리고 양식장에서 산란에 이용되고 있는 일반 넙치 암컷의 난과 수정시켜 얻은 수정 및 발생 능력에 대한 결과는 다음과 같다. 1. 정소의 조직학적 분석 결과 자성발생성 2배체 숫컷은 대조군과 마찬가지로 조직학적 차이가 없고, 정소내에서 정자 변태과정을 수행하는 것으로 나타났다. 2. 자성발생성 2배체 숫컷 넙치의 체중 1 kg 당 정액의 양은 20.6 ml 로써 대조군의 8.3 ml 에 비해 두 배 이상 많게 나타났다(P<0.01). 3. 정액 1 ml 당 정자의 수는 대조군에서 $2.58\times10^9$ 그리고 자성발생성 2배체 숫컷 넙치의 경우 $2.42\times10^9$ 으로 나타나 1 ml 당 정세포의 수는 두 군간 통계적으로 유의한 차가 나타나지 않았다. (P>0.05). 4. 정자의 크기를 조사한 결과 두부의 장경, 단경 및 정자의 길이에서 모두 차이가 없는 것으로 나타났다(P>0.05). 또한 두 군 정자의 형태를 분석한 결과. 외형상 차이를 발견할 수 없었다. 5. 자성발생성 2배체 숫컷 넙치의 수정 및 발생능력 평가를 위해 대조군의 난을 얻어 수정시킨 결과 난질에 따라 다소 차이를 보였으나, 수정율 및 부화율 모두 $80\%$ 이상으로 나타나 성 유전자에 따른 발생 능력의 차이는 없는 것으로 나타났다.
당뇨병은 생식내분비 조직의 구조나 기능 변화를 유발하여 호르몬 합성 및 분비량의 변화를 야기하고, 정자의 운동성 등에 영향을 미치는 것으로 알려져 왔다. 그러나 부정소와 수정관내 정자의 농도 변화나 수정능력 획득 및 침체반응에 미치는 영향은 잘 알려져 있지 않다. 본 실험에서는 Wistar 쥐에 streptozotocin을 투여하여 당뇨병을 유발시킨 후 3일과 14일에 부정소 각 부위와 수정관내 정자 농도 변화를 조사하고 부정소 꼬리와 수정관내 정자의 침체반응 유도 실험 (acrosome reaction to ionophore challenge test, ARIC test)을 이용하여 정자의 수정 능력을 평가하였다. Streptozotocin을 주사한 후 혈액내 인슐린 및 포도당 농도는 당뇨병 경과 기간이 길어짐에 따라 반비례 관계를 보였다. 부정소 머리와 몸통내 정자의 농도는 3일군에서부터 감소하기 시작하나 꼬리에서는 14일군 $(15.2{\pm}2.1)$에서 대조군 $(28.1{\pm}4.0)$이나 3일군에 $(24.8{\pm}2.9)$비해 유의하게 감소하였다. 수정관내 절자 농도는 14일군이 $0.025{\pm}0.013$으로 대조군과 $(0.108{\pm}0.03)$ 3일군에 $(0.067{\pm}0.046)$ 비해 유의하게 감소하였으며, 3일군도 대조군에 비해 유의한 차이를 보였다. 자발적 첨체반응율은 대조군의 부정소 꼬리정자는 $37.1{\pm}2.4$이고 수정관내 정자는 $49.3{\pm}2.4$로 두 부위간 유의한 차이를 보였다. 3일군과 14일군의 부정소 꼬리와 수정관내 정자의 자발적 첨체반응율은 대조군에 비해 유의하게 증가하였다. 한편 14일군의 수정관내 정자의 자발적 첨체반응율은 대조군이나 3일군에 비해 유의하게 증가하였다. ARIC test 결과 대조군과 3일군에서는 20%이상 차이를 보였으나 14일군에서는 약 8.4% 차이를 보였다. 위의 결과가 부정소의 성숙 조절기능 이상 또는 정자형성 이상에 기인한 것인지는 더 연구되어야 하나 당뇨병 병력이 길어짐에 따라 정자의 수적인 감소, 자발적 침체반응의 증가나 침체반응의 약화가 유발되어 생식능력의 감소 원인으로 작용하는 것으로 사료된다.
본 연구에서는 반응성 산소족이 수정능력획득, 칩체반응에 미치는 영향을 알아보고자 반응성 산소족으로 superoxide anion은 xanthine (X) -xanthine oxidase (XO) system을, hydroperoxide는 $H_2O$$_2$를 농도별로 처 리하였으며, nitric oxide (NO)는 NO donor인 sodium nitroprusside (SNP)를 처리하였다 또한 남성불임요인의 하나로 알려진 leukocytospermia에 대한 영향을 알아보기 위해 lymphocyte를 농도별로 처리하였고, 일반적인 배양기내 산소농도인 20% $O_2$농도를 생체내 농도와 유사한 5% $O_2$ 농도로 낮추었을 때 의 결과를 알아보고자 하였다. 수정능력 획득 정도와 첨체반응률을 알아보기 위해 chlortetracycline (CTC) 염색방법을 이용하였다. 지질과산화 정도는 정자내 malondialdehyde (MDA)의 생성량을 흡광기를 이용하여 정량하였다. $H_2O$$_2$, X-XO, SNP와 lymphocyte 처리군은 1시간 배양시에 수정능력획득률이 유의하게 증가하였으나, 저산소처리군에서는 차이가 없었다. 저 농도의 $H_2O$$_2$를 처리한 경우에는 지질과산화 정도가 감소하였으나, 고 농도에서는 대조군에 비해 유의하게 증가하였다. 고 농도의 Iymphocyte를 처리한 경우에는 1시간 처리시에 지질과산화가 유의하게 증가하였으나, 처리된 산소농도에 따른 지질과산화의 차이는 없었다. 첨체반응률의 경우, 처리한 모든 반응성 산소족에서 대조군에 비해 높은 첨체반응률을 확인하였다. X(100 $\mu$M)-XO(100mIU)의 경우가 가장 높은 첨체반응률을 나타내었다. 이러한 결과들은 반응성 산소족이 수정능력획득, 지질과산화 그리고 첨체반응에 영향을 미치는 것을 확인하여 주었다. 또한 반응성 산소족이 생성된 경우에 수정능력획득이 보다 빠르게 진행되어지는 것은 반응성 산소족이 정자의 과운동성과 수정능력획득의 중요한 조절자임을 시사한다고 사료된다.
체외에서 포유동물의 난자와 정자의 배양에 관한 연구는 난자의 성숙과정과 수정현상에 대한 많은 새로운 정보를 제공하였다. 동시에 체외수정의 연구로부터 얻은 결과는 또다른 의문을 제기하였다. 특히 동결융해정액을 이용한 돼지체외수정의 경우 낮은 정자의 침입율과 전핵형성율 및 높은 다정자침입(polyspermy)율은 아직도 해결해야할 문제점으로 남아있다. 돼지난자의 성숙에 관한 연구의 성과는 수정후 낮은 전핵형성율을 개선시켰으나 타동물종에 비하면 아직도 매우 낮게 나타나고 있다. 한편 동결정액의 처리를 위하여 caffeine이나 Ca2+와 같은 물질을 수정용 배지내에 첨가하는 등 수정능력획득의 유기를 위하여 여러 가지 방법이 연구되고 있지만 정자의 침입율은 아직도 낮고, polyspermy의 발생율은 높게 나타내고 있다. 따라서 정자의 침입율을 향상시키고 polyspermy를 억제하기 위하여 난관세포와의 공동배양, 난포액을 첨가한 배양액 내에서 정자의 전배양 및 정자농도의 조절은 매우 효과적인 방법으로 이용되어왔다. 그러나 수정란의 체외생산성 향상과 이와 관련된 연구를 보다 효과적으로 수행하기 위해서는 위에서 지적한 문제에 영향을 미치는 요인에 대한 보다 근본적인 이해가 요구된다.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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