본 연구에서는 저온고압 추출공정을 이용하여 전통적인 기존 추출공정과 비교함으로써 저온고압 추출공정에 의한 매자나무 수피의 항산화활성과 항암활성의 증진을 확인하고자 연구를 수행 하였다. DPPH radical 소거 활성은 5분 저온고압 처리한 추출물이 93%로 가장 높은 활성을 나타내며 대조군인 ascorbic acid의 95%와 유사한 활성을 나타내었다. 저온고압 추출공정을 통한 매자나무 추출물이 일반 열수 추출물과 비교해 xanthine oxidase 저해활성이 높게 나타났으며 특히 5분 저온고압 처리한 추출물이 56.68%의 높은 저해 활성을 나타냈다. 따라서 저온고압 추출공정을 통해 매자나무 추출물의 항산화 활성의 증진이 이루어졌음을 알수 있다. 항암활성 측정 결과, 매자나무 수피 추출물의 높은 항암활성을 확인하였으며 5분 저온고압 처리한 추출물의 암세포 억제 활성이 가장 높게 나타남에 따라 저온고압 추출공정을 통해 항암활성의 증진이 가능함을 확인하였다. 세포독성 측정 결과 5분 저온고압 추출물이 정상 세포에 대한 독성이 가장 높은데 반해 15분 저온고압 처리한 추출물의 세포독성이 제일 낮은 것으로 미루어 저온고압 추출물의 세포독성이 저온고압 추출시간의 영향을 받는 것으로 사료된다. 따라서 매자나무 수피의 생체적용이 가능한 기능성 소재로서의 이용 가능성을 확인할 수 있으며 저온 고압 추출공정의 최적화를 통한 활성물질의 추출 극대화를 통해 높은 경제적 가치를 부여해 줄 수 있을 것으로 사료된다.
저온 또는 건조 처리에 따른 토마토 유묘의 생육과 부위별 항산화효소의 반응 양상을 분석한 결과, 토마토 유묘의 생체중은 처리 후 12일째에 대조구에 비해 각각 69.5% 와 50.6% 감소하였다. SOD와 POD의 활성은 대조구에 비해 저온 또는 건조 처리에서 높은 활성을 보였는데, 저온 처리시에는 뿌리에서 더 높은 활성을 보였고 건조 처리에서는 잎과 줄기에서 높은 활성을 보였다. 이러한 결과는 동위효소의 발현양상에서도 일치하였다. GR의 활성은 저온 또는 건조 처리시 대조구보다 높은 활성을 보였는데, 잎과 줄기에서는 저온과 건조 처리간의 차이는 없었지만, 뿌리에서는 건조 처리가 높은 경향을 보였다. GR 동위효소 발현양상은 저온과 건조처리시에는 GR-3 밴드가 잎에서는 발현되어 대조구와 차이가 있었지만, 줄기와 뿌리에서는 큰 차이가 없었다. PPO 활성은 잎에서는 모든 처리에서 차이가 없었지만, 줄기와 뿌리에서는 저온 또는 건조 처리에서 대조구보다 높은 경향을 보였다. 특히 줄기의 PPO 활성은 저온 처리보다 건조처리에서 높았고 뿌리의 PPO 활성은 건조 처리보다 저온 처리에서 높았다. 동위효소의 발현양상에서도 건조처리에서는 줄기에서, 저온 처리에서는 뿌리에서 높은 밀도를 보여 불량 환경에 따른 부위별 반응 차이를 잘 반영해 주었다.
저온이 IAAO의 활성에 미치는 영향을 구명하기 위하여 암실(暗室)에서 재배한 완두(Pisum sativum L. var. Sparkle)의 유묘(幼苗)를 재료로 저온처리 기간과 그 후의 IAAO의 활성변화를 측정(測定)하였다. 줄기의 끝 5mm 부위의 IAAO활성이 그아래 5mm 부위의 그것보다 $2{\sim}3$배 낮았으며, 뿌리의 IAAO활성은 줄기의 그것보다 $4{\sim}15$배 높았다. 저온 처리시 줄기의 IAAO활성은 증가하였으나 뿌리에서는 오히려 억제(抑制)되는 경향을 보였다. 저온처리를 받은 유묘(幼苗)를 다시 정상생육 온도$(25^{\circ}C)$로 옮기면 IAAO 활성은 대조구의 수준으로 회복하는 경향이었다. 조직 부위에 따른 효소 활성의 차이가 저온에대한 줄기와 뿌리의 서로 다른 효소 활성 변화 양상은 동질효소(同質酵素)인 IAAO의 조절기구(調節機構)가 조직에 따라 상이(相異)할 수 있음을 시사하는 것이였으며 식물계(植物界)에 널리 분포(分布)하는 IAAO보조인자(補助因子)인 페놀 화합물류의 소장(消長)과 일부 관계가 있는 것처럼 보였다.
극지연구소(KOPRI)는 국내외적으로 유일하게 남북극 지역에서 분리한 저온적응성 박테리아 균주를 대상으로 culture collection(약 6,300균주)을 구축하여 운영하고 있다. 보유 중인 프로테아제(protease) 생산 균주들(총 874균주) 중에서 활성이 높은 프로테아제를 생산하는 78개의 균주들을 1차 선발한 후, 1% skim milk가 포함된 0.1${\times}$ ZoBell 고체배지에 접종하고 다양한 온도($5-30^{\circ}C$)에서 배양하면서 세포외분비성 프로테아제의 활성을 비교하였다. 위의 신속하고 직접적인 균주 스크리닝 방법을 통해서, 최종적으로 저온활성 프로테아제를 생산하는 15개의 저온적응성 균주들을 선발하였다. 최종 선발된 균주들은 16S rRNA 유전자의 분석결과 Pseudoalteromonas (13균주)와 Flavobacterium (2균주) 속(genus)으로 분류되었고, $5-15^{\circ}C$ 저온에서도 활성을 나타내는 저온성 프로테아제를 생산하였다. 15개 균주들이 생산하는 각각의 프로테아제는 특이적 화합물에 의한 효소활성 억제 정도에 따라 5개의 그룹(serine protease, aspartic protease, cysteine protease, metalloprotease, 그리고 미분류 프로테아제)으로 분류되었다. 본 실험을 통해서 선발한 남북극 유래 박테리아 균주들은 새로운 저온활성 프로테아제를 발굴하기 위한 유용한 생물자원으로서의 가치를 가지고 있다.
저온 처리($4^{\circ}C$)가 벼(Oryza sativa L. cv. Samjin) 유식물 잎의 환원당, 설탕, 녹말 및 fructose-2,6-bisphosphate(F-2,$6-P_2$)의 함량에 미치는 영향을 조사하였으며, 이와 관련있는 amylase, invertase 및 fructose-1,6-bisphosphatase(FB-Pase)의 활성변화를 중심으로 3일 동안 측정하였다. 3일 동안 저온처리한 벼 유식물에서의 환원당과 설탕의 함량은 증가하였고, 수용성 녹말과 비수용성 녹말의 함량은 감소하였다. 한편, amylase의 활성은 증가하였고 acid invertase의 활성을 감소하였으며, alkaline invertase의 활성은 변화가 없었다. 스트로마 및 시토졸 FBPase의 활성은 감소하였다. 이에 부합되는 것으로 F-2,$6-P_2$의 함량이 감소하였다. 그러므로, 저온처리로 환원당의 함량이 증가한 것은 녹말 분해능의 증가에 기인한 것으로 사료되며, 설탕의 함량이 증가한 것은 설탕 분해능의 저하와 F-2,$6-P_2$의 함량감소에 따른 시토졸 FBPase의 활성증가에 기인한 것으로 해석된다. 또한 저온에 의한 이러한 탄수화물 대사의 변화는 벼 유식물의 저온 손상을 일부나마 방지하려는 기작이라 해석된다.
벼 약배양에 있어서 배양약의 viability의 변화를 관찰하고자 밀양 2003, 대청벼, 치악벼를 재료로 품종 및 저온전처리, 약의 갈변에 따른 호흡율의 변화를 2~3일 간격으로 조사하였다. 화분의 발육시기에 따른 배양전 약의 호흡활성은 개화직전에 가장 높았으며, 배양적기인 stage 3~4에서의 호흡율은 12.46 $O_2$ n mode/ml/h/another이었다. 배양약의 호흡활성의 변화는 3~9일경에 1차 정점을, 9~11일경에 2차 정점을 나타냈으며, Callus 형성능이 높은 대청벼에서 가장 높게 나타났다. 저온전처리는 배양 초기의 호흡활성을 저하시켰으나 15일경부터는 무처리구 보다 높은 경향이었다. 또한 저온전처리는 약의 갈변을 촉진하였으며, 갈변약에서 호흡활성이 높았다.
남극 해양세균 Pseudoalteromonas arctica PAMC 21717로부터 저온활성 alkaline protease (Pro21717)를 부분정제하였다. Pro21717 효소 추출액은 skim milk를 포함하는 zymogram gel 상에서 약 37 kDa (낮은 활성)과 74 kDa (높은 활성) 위치에서 두 개의 뚜렷한 투명밴드(clear zone)를 형성하였다. 단백질 분해활성을 나타내는 두 개의 효소단백질은 동일한 N-말단 아미노산 서열을 가지고 있었으며, 하나의 유전자에서 발현된 미성숙 단백질(precursor)이 37 kDa 크기의 단백질분해효소로 성숙화과정을 거친 후 74 kDa 크기로 이량체화됨으로써 좀 더 높은 활성을 가지는 것으로 판단된다. Pro21717은 $0-40^{\circ}C$ (최고활성 온도 $40^{\circ}C$) 온도 범위에서 단백질분해활성을 나타내었고 pH 5.0-10.0 (최적 pH 9.0) 범위에서 효소활성을 유지하였다. 주목할만한 특성으로써, Pro21717은 $40^{\circ}C$에서의 최고 효소활성(100%) 대비, $0^{\circ}C$와 $10^{\circ}C$에서 각각 30%와 45%의 높은 저온활성을 나타내었다. 또한 다양한 합성 펩타이드류에 대해 분해활성을 나타내는 Pro21717은 $Cu^{2+}$에 의해 활성이 증가하였으며, 시판용 세탁세제(commercial detergent formulation)에 포함되어 있는 다양한 종류의 계면활성제, 화학성분, 금속이온에 의해 활성이 감소되지 않았다. 전반적으로 저온활성 Pro21717은 글로벌 상업용효소 생산회사 Novozymes이 시판하고 있는 중온성 효소 Subtilisin Carlsberg (trademark Alcalase)에 버금가는 유용한 효소학적 특성이 있는 동시에 상대적으로 더 높은 저온활성을 보여주고 있다. 위의 실험결과들은, Pro21717은 $15^{\circ}C$ 이하의 차가운 수돗물에서도 세척력을 유지하는 새로운 세탁세제 효소첨가제로서의 개발 가능성을 보여주고 있다.
상추식물에서 저온 처리를 하였을 때 저온 적응성 획득 메카니즘과 관련된 APX와 DHAR의 활성도와 mRNA 발현 수준 등과의 관련성을 조사한 결과는 다음과 같다. 잎 조직내 과산화수소의 함량은 일정하게 증가하다가 $20^{\circ}C$에서 저온처리를 회복시키면 그 함량이 정상상태로 회복하는 경향을 보였으나 단백질의 함량은 반대의 경향을 나타내었다. 엽록소의 함량은 저온스트레스를 처리할 경우 엽록소 a와 b 및 총 엽록소의 함량이 점차 감소하는 경향을 보였으며 저온스트레스 회복 시 다시 증가하는 경향을 보였으나 카로티노이드 함량의 변화는 거의 일어나지 않고 일정한 수준을 유지하는 것으로 나타났다. 총 엽록소에 대한 엽록소a의 비율은 저온처리 12시간까지는 증가하다가 24시간 이후 급격하게 감소하게 되고 저온스트레스를 회복시켰을 때 정상 수준으로 회복되는 경향을 나타내었다. APX와 DHAR의 활성도는 저온 처리가 진행됨에 따라 상추의 잎 조직 내에서 급격하게 증가하는 경향을 보이고 있으나 적온으로 회복시키면 정상 수준으로 유지되었다. 저온처리 시간이 경과함에 따라 APX와 DHAR의 mRNA의 발현 수준이 크게 증가하는 경향을 보였다가 원래 수준으로 회복되었다. APX의 활성도와 과산화수소의 함량과의 상관관계는 상추의 잎 조직 내 과산화수소의 함량이 증가하면 APX의 활성도가 증가하는 경향 ($R^2$=0.8715)을 보였으며, DHAR의 활성도와 과산화수소의 함량도 동일한 경향으로 증가($R^2$=0.8643)하였다. 그러나 과산화수소의 생성량이 증가함에 따라 엽록소의 함량과 단백질의 함량은 저온 스트레스처리로 과산화수소의 생성량이 증가하면 엽록소의 함량($R^2$=0.5021)과 수용성단백질의 함량과는 감소하는 경향($R^2$=0.8915)을 보였다.
무 유식물에서 acid phosphatase의 활성은 산성인 pH 5.5에서 최대치를 보였다. 0.5 mM ABA처리로 acid phosphatase의 활성이 대조구보다는 오래 지속되였고, 0.5 mM NaCl 처리시 도 acid phosphatase 활성의 변화는 ABA 처리 때와 유사하였다. 그러나 저온처리를 하면, 대조구에 비해서 효소의 활성이 급속히 감소되었다가, 대조구의 acid phosphatase는 거의 같은 활성을 유지하는 동안 처리구의 acid phosphatae의 활성은 6 일까지 서서히 증가되었다. Acid phosphatase는 저온처리, ABA와 NaCl처리에 대항하여 식물이 스트레스에 대처하도록 생화학적인 반응에 관하는 것으로 보인다.
쇠비름의 활용 및 생리활성을 증가시킬 수 있는 적정 추출방법을 알아보고자 환류냉각, 가압가열 및 저온고압 추출법을 이용하여 추출한 쇠비름 70% 에탄올 추출물의 생리활성을 비교하였다. 추출수율은 환류냉각추출, 가압가열추출, 저온고압추출 순으로 높은 수율을 나타내었다. 색도에서는 저온고압추출에서 명도와 황색도가 높았고, 채도의 경우 가압가열 및 저온고압추출에서 높았다. 폴리페놀 및 프로안토시아니딘 함량은 저온고압추출이 환류냉각 및 가압가열추출에 비해 높은 함량을 나타내었으며, 플라보노이드 함량은 가압가열추출에서 높은 함량을 나타내었다. 항산화 활성은 저온고압추출이 환류냉각 및 가압가열 추출에 비해 유의적으로 높은 활성을 나타낸 반면 철 이온에 대한 제거효과의 경우 환류냉각추출 및 가압가열추출에서 높은 활성을 나타내었다. ${\alpha}$-Glucosidase 및 XO 저해활성은 저온고압추출에서 가장 높은 활성을 나타내었다. 한편 AChE 저해활성에서는 저온고압추출, 가압가열추출, 환류냉각추출 순으로 높은 활성을 나타내었고, TLC bioassay를 통하여 살펴본 결과 특정 compound들에 의해 AChE 저해 활성이 나타났으며 퇴행성 질환의 하나인 치매의 예방 가능성을 확인하였다. 이러한 결과를 종합해 볼 때 저온고압추출물이 소재 활용가치가 높을 것으로 사료되며 천연항산화제 및 기능성 증진을 위한 소재로 이용 가능할 것으로 판단된다.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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