• KSBB Journal
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• 제19권4호
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• pp.327-330
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• 2004

Inducible system을 이용하여 (R)-hydroxybutyric acid (R3HB)를 생산하는 재조합 대장균을 개발하였다. Ralstonia eutropha에서 유래한 PHB depolymerase 유전자를 inducible promoter에 의하여 발현되게 만들고, PHB 생합성 유전자가 있는 vector에 cloning하였다. PHB 생합성 유전자와 depolymerase 유전자를 가지고 있는 재조합 대장균을 배양하여 먼저 PHB를 축적시킨 후에 depolymerase를 발현시켜 배지 내로 분비된 R3HB를 확인하였다. 그 결과 축적된 PHB의 대부분은 발현된 depolymerase에 의하여 분해되었으며, depolymerase의 발현 이후에도 재조합 대장균은 PHB를 축적하고 분해하여 R3HB의 농도는 배양시간에 따라 증가하였다. 이러한 결과는 inducible depolymerase를 갖는 재조합 대장균을 이용하여 높은 농도의 R3IB를 얻을 수 있다는 것을 보여준다.

• KSBB Journal
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• 제10권3호
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• pp.249-256
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• 1995

${\gamma}$-Glutamylcysteine 생산에 있어서 재조합 대장 균 HB101/pGH501만을 이용한 단일세포반응계가 재조합 대장균과 효모를 이용한 흔합서l포반응계보다 반응시간이 짧고 생산농도가 높은 것으로 나타났다. 그러나 생산경제성 측면에서 ATP 재생공정을 위하 여 훈합세포반응계를 사용하였다. 재조합 대장균과 효모를 이용한 혼합세포반응계에서 대장균과 효모의 비율은 1:4가 적합함을 보였고, ATP 재생공정에 사용되는 glucose는 O.5M의 농도에서 가장 효율적 으로 나타났다. 재조합 대장균과 효모를 alginate를 이용하여 고정화하여 반응계로 사용하였을 경우 반 응에 필요한 시간이 걸어지고 생산놓도도 감소되냐 반응계의 안정성은 10% 정도 증가됨을 알 수 있었다. 실험결과 alginate로 고정화된 흔합세포반응계 를 사용하여 ${\gamma}$-glutamylcysteine를 연속 생산할 수 있음을 확인하였다.

• 한국생물공학회:학술대회논문집
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• 한국생물공학회 2001년도 추계학술발표대회
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• pp.321-324
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• 2001

R. eutropha 의 PHA 생합성 유전자를 포함하는 플라스미드 pSYLl07을 가진 재조합 대장균 GCSC6576 과 A. latus PHA 생합성 유전자를 포함하는 플라스미드 pJC4 한 가진 fadR atoC 돌연변이주 재조합 대장균 LS5218 의 유청으로부터 P(3HB- co -3HV) 합성을 비교하였다. 재조합 대장균 LS5218의 pH-stat 유가식 배양결괴 39 시간에 균체농도 31.8 g/L. P(3HB-co-3HV) 농도 10.6 g/L. P(3HB-co-3HV) 함량 33.4 wt%. 3HV 함량 6.26 mol%를 얻을 수 있었다.

• KSBB Journal
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• 제18권5호
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• pp.404-407
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• 2003

R. eutropha의 PHA 생합성 유전자를 포함하는 플라스미드 pSYL107을 가진 재조합 대장균 GCSC6576과 A. latus PHA 생합성 유전자를 포함하는 플라스미드 pJC4를 가진 fadR atoC 돌연변이주 재조합 대장균 LS5218의 유청으로부터 P(3HB-co-3HV) 합성을 비교하였다. 재조합 대장균 GCSC6576(pSYL107)의 플라스크 배양에서 acetic acid induction과 oleic acid의 첨가는 3HV 함량을 증가시켰다. 재조합 대장균 LS5218의 pH-stat 유가식 배양결과, 39시간에 균체농도 31.8 g/L, P(3HB-co-3HV) 농도 10.6 g/L, P(3HB-co-3HV) 함량 33.4%, 3HV 함량 6.26 mol%를 얻을 수 있었다.

• 한국응용약물학회:학술대회논문집
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• 한국응용약물학회 1993년도 제2회 신약개발 연구발표회 초록집
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• pp.138-138
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• 1993

인슈린 유사체를 유전공학적 방법으로 생산하여 새로운 당뇨병 치료제로써의 가능성을 타진한다. 인슈린 B 사슬의 C 말단 아미노산 codon을 threonine 대신을 methionine을 지령하도록 하고 여기에 인슈린 A사슬을 지령하는 염기를 바로 부착시켜, 이를 대장균에서 발현시키므로써 외사슬 인슈린 선구체를 제조하고, 이를 분리 정제한 다음 취화브롬 으로 절단하므로서 ($B^{30}$-homoserine) 인슈린을 제조한다. 1. 외사슬 인슈린 전구체 유전자를 합성한 후 대장균의 발현 운반체내 e-galactosidase 유전자와 융합시켜 도입하므로서 재조합된 융합단백질을 생산하였다. 2. 재조합 대장균을 발효한 후 urea 융합단백질을 분리하고 DEAE-Sephacel과 Sephadex G-200을 이용하여 순수 정제하였다.

• 생명과학회지
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• 제22권8호
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• pp.1024-1033
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• 2012

Kocuria gwangalliensis로부터 카로티노이드 생합성 경로의 첫 번째 단계 기질인 geranylgeranyl pyrophosphate (GGPP)를 생합성하는 GGPP synthase (CrtE)를 암호화하고 있는 crtE를 클로닝 하여 이를 KgGGPP로 명명하였다. 기존 세균에서 밝혀진 GGPP synthase의 아미노산 서열을 NCBI에서 검색하여 KgGGPP synthase의 아미노산 서열과 비교한 결과 Kocuria rhizophila와 59.6%의 상동성을 가지는 것을 확인하였다. crtE 유전자를 대장균에서 발현 시키기 위하여 pCcrtE 재조합 DNA를 구축하였고, 이를 대장균에서 발현시킨 결과 약 41 kDa의 재조합 단백질이 과발현 됨을 확인 할 수 있었으며, 이 단백질은 기존 세균에서 밝혀진 GGPP synthase와 유사한 분자량을 가지고 있다는 것을 알 수 있었다. CrtE 재조합 단백질의 활성을 분석하기 위하여 대장균 내에서 라이코펜의 생합성을 유도 하였다. 대장균의 경우 메발론산 경로를 통하여 FPP와 IPP를 생합성 하지만 crtE, crtB, crtI 유전자가 없기 때문에 라이코펜을 생합성 하지는 못한다. 대장균 내에서 라이코펜의 생합성을 위해서는 crtE, crtB, crtI 유전자의 발현이 필수적으로 요구되기 때문에 crtB, crtI 유전자의 경우는 P. haeundaensis에서 유래한 유전자를 이용하여 pRScrtBI 재조합 DNA를 구축하여 그 발현을 유도하였다. 상기 두 재조합 DNA를 대장균에서 공발현 시켰으며, HPLC 분석법을 이용하여 대장균 내에서 라이코펜의 생산 유무에 따른 KgGGPP synthase의 활성을 분석하였다.

• 한국미생물·생명공학회지
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• 제44권1호
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• pp.55-61
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• 2016

본 연구에서는 $BH_4$를 대체할 수 있는 유용물질인 세피아프테린의 생산성 증대를 위하여 GTP 생합성 경로의 유전자들을 동시에 발현할 수 있는 재조합 대장균을 제작하였다. 세피아프테린을 생산할 수 있는 재조합 대장균에서 gmk, ndk 및 guaA-guaB 유전자를 동시에 발현함으로써 세포 내 GTP의 농도가 대조구에 비해 약 200% 이상 증가하였고 $126.1{\pm}9.3mg/l$의 세피아프테린이 생산되었는데 이 결과는 대조구보다 세피아프테린의 생산량이 약 43% 증가된 것이다. GTP 생합성에 관여하는 개별 유전자의 단독 발현 또는 두 가지 유전자의 동시 발현은 세포 내 GTP 농도 향상 큰 영향을 미치지 못했지만 네 가지 유전자 모두를 동시에 발현하는 경우는 세포 내 GTP 농도를 유의적으로 증가시킨다는 것이 확인되었다. 결론적으로 세포 내 GTP 생합성에 관여하는 guaA-guaB, gmk 및 ndk 유전자를 동시에 발현함으로써 재조합 대장균에서 세피아프테린의 생산성 증가를 달성하였다.

• 자연과학논문집
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• 제16권1호
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• pp.1-13
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• 2005

안지오텐신(ACE) 저해제는 항고혈 효과를 갖고 있으므로 오랫동안 고혈압의 예방이나 치료에 이용되어 왔다. 본 연구는 재조합 대장균으로부터 새로운 ACE 저해제를 생산하고 정제하며 나아가 이들이 구조-기능 관P를 규명하기 위해 수행되었다. Saccharomyces cerevisiae의 ACE 저해 펩타이드 유전자를 함유하고 있는 재조합 pGEX-4T-3을 대장균 BL21(DE3)로 형질전환 시켰다. 재조합 pGEX-4T-3을 갖고 있는 대장균 BL21(DE3)로부터 생산된 Glutathione-s 전이효소(GST) 융합 단백질을 얻어서 그중 ACE저해 펩타이드를 Sephadex G-25 컬럼 크로마토그래피로 정제하였다. 정제된 ACE 저해 펩타이드는 타이로신-아스파틱엑시드-그리신-글리신-발린-페닐알라린-아르기닌-발린-타이로신-트레오닌의 서열을 가진 새로운 decapeptide이었고 ACE에 대하여 경쟁적으로 저해하였다.

• KSBB Journal
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• 제10권5호
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• pp.575-581
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• 1995

Plasmid pTTY2에 의한 competent cell(P90c/$\phi$ 434)의 형질전환에 의하여 lipase를 생성하는 재조합 대장균(P90c/따434/pTTY2)을 합성하였다. Li pase 활성 조사를 위한 LAT plate, Rhodamine B plate를 이용한 실험에서 P90c/$\phi$434의 경우 halo 형성이 없었고, P90c/$\phi$434/pTTY2의 경우 용해시 켜 얻은 상등액과 용해되지 않은 미생물을 물리적으 로 깨 서 얻은 상등액 모두 halo를 형성하였다. P90c/$\phi$434/pTTY2에 대한 IPTG 유도시점, 유도 시간이 $\phi$434에 의한 미생물 용해에 미치는 영향을 살펴 봄으로써 다음과 같은 결론을 얻었다. 1. 재조합 대장균의 효과적인 용해는 ODGOO 0.5 ~ 2 2.5인 초기 exponential growth phase에서 IPTG 로 유도한 후, mitomycin C 첨가나 uv조사에 의 해 이루어진다. 2. 재조합 대장균의 용해는 IPTG 유도시간이 1 시간일 때 가장 효과적이었으며, 이후 유도시간이 증가할수록 감소하여 유도시간이 4시간일 때는 세포 용해가 이루어지지 않는다. 3. 실험한 범위에서 uv조사보다 mitomycin C 첨가가 세포 용해에 더 효과적이다. 본 연구결과가 대규모의 생물공학 생산물의 정제 에 응용되기 위해서는 고농도 세포에서의 세포용해 에 대한 연구가 펼요한 것으로 판단된다.

• 한국미생물·생명공학회지
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• 제32권3호
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• pp.243-248
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• 2004

산업적 R3HB의 생산을 위한 재조합 대장균의 pilot규모에서의 유가식 배양과 연속식 배양을 연구하였다. Pilot 규모에서의 R3HB생산을 위하여 안전한 two plasmid system pBRRed와 pMCS 105를 제작하였으며, 제작된 plasmids을 이용하여 여러 다른 대장균을 형질 전환하였다. 얻어진 재조합 대장균들을 30 l의 발효기에서 회분식 배양한 결과 대장균 XL-10 Gold(pBRRed, pMCS105)가 가장 높은 R3HB 농도를 보였다 30 1 발효기에서 대장균 XL-10 Gold (pBRRed, PMCS105)을 유가식 배양한 결과 22.4 g/1의 R3HB가 얻어졌으며, 생산성은 0.97 g/1-h를 보였다. 고농도의 R3HB를 고생산성으로 얻기 위하여 유가식 배양으로 높은 균체 농도를 얻은 후 연속 배양으로 R3HB를 생산하는 전략을 개발하였다. 그 결과 0.2 $h^{-1}$ 의 dilution rate에서 R3HB 생산성은 5.06 g/1-h를 보였다. 이러한 결과는 산업적 규모에서 재조합 대장균을 이용하여 R3HB를 고농도, 고생산성으로 얻을 수 있다는 것을 보여준다.