• 식물병연구
• /
• 제15권2호
• /
• pp.120-126
• /
• 2009

Botrytis cinerea 균주의 병원성에 있어서 phytotoxin의 역할을 규명하는 연구를 하던 중에 B. cinerea 2-16균주가 생산하는 새로운 phytotoxin을 분리 동정하였다. 두 개의 물질은 3-O-acetyl botcinol과 3-O-acetyl botcinolide로 동정되었다. 본 연구는 두 개의 물질과 B. cinerea의 병원성과의 상관관계를 규명하고자 실시하였다. 25개의 B. cinerea 균주 중에서 병원성이 약한 3개의 B. cinerea 균주는 액체배지에서 두 phytotoxin을 생산하지 않았다. 병원성이 강하거나 중간정도인 균주들은 두 phytotoxin을 생산하는 균과 생산하지 않는 균으로 나뉘었다. 한편, 25개의 균주 중에서 10균주의 액체배양액 에틸아세테이트 추출물이 9개의 식물체를 이용한 whole plant assay에서 phytotoxicity를 나타냈으며, 이들 10개 추출물 모두에서 두 phytotoxin이 검출되었다. In planta 실험에서는 병원성이 강한 균주에 감염된 식물조직에서 모두 두 phytotoxin이 검출되었다. 하지만 두 phtotoxin의 생산량과 병원성과는 상관관계를 보이지 않았다. 두 phytotoxin은 B. cinerea 2-16 균주에 감염된 토마토 조직에서 3일째부터 검출되기 시작해 4일째는 가장 크게 증가하였으며 그 후 감소하였다. 이상의 실험 결과 3-O-acetyl botcinol과 3-O-acetyl botcinolide는 B. ciuereo의 발병과정에 있어서 중요한 역할을 할 것으로 추정되지만 병을 일으키는데 일차적인 요인은 아닐 것으로 사료된다.

• 한국식품영양과학회지
• /
• 제37권6호
• /
• pp.784-791
• /
• 2008

Aspergillus sp.와 Rhizopus sp.의 누룩과 효모(Saccharomyces cerevisiae)로 접종한 후, 올방개의 함량을 0, 10, 20, 30, 40, 50%로 담금하여 얻은 술덧의 성분과 향기성분 그리고 관능검사로 비교한 결과는 다음과 같다. 술덧의 주정도는 발효 $3{\sim}5$일 사이에 가장 많은 알코올 발효가 일어나 $15.3{\sim}16.4%$로 나타냈으며 올방개가 10% 함유한 실험구가 16.4%로 가장 높았으며, 올방개의 함량이 증가할수록 주정도가 낮아져 50% 올방개 약주의 주정도는 15.3%였다. 아미노산도는 $0.90{\sim}1.20%$이었으며, 올방개 10%와 20% 첨가구에서 아미노산도가 1.20%로 가장 높았으며, 환원당은 올방개 10%일 때 8.2로 가장 낮았고, 이는 올방개의 함량이 증가할 수록 점점 높아졌다. 올방개를 첨가한 술덧의 유기산은 구연산, 호박산, 사과산, 초산이 검출되었으며 초산 함량이 $160.3{\pm}8.0{\sim}253.3{\pm}20.3mg/100mL$로 가장 많이 검출되었다. 총유기산은 20% 술덧이 $330.9{\pm}28.6mg/100mL$로 가장 높게 확인되었으며 50% 술덧이 $17.14{\pm}9.3mg/100mL$로 가장 낮게 분석되었다. 각 술덧별 주요 아미노산은 알라닌, 프롤린, 히스티딘, 페닐알라닌, 라이신, 글루타믹산 등이었으며 총 17종이 검출되었고 올방개 20% 첨가한 술덧에서 총 아미노산이 $341.1{\pm}30.7mg%$로 가장 많은 양이 검출되었다. 효모 수는 발효종료 7일에 $4.4{\sim}6.2{\times}10^8cells/mL$가 검출되었다. 각 술덧별 향기성분은 흡착법(SPME)으로 분석한 결과 10종이 검출되었으며, 주요 향기성분은 에틸아세테이트, 이소아밀알코올, 이소뷰틸알코올로 올방개 20% 술덧에서 향기성분이 높게 검출되었다.

• 생명과학회지
• /
• 제25권7호
• /
• pp.786-794
• /
• 2015

본 연구는 황금찰수수의 에탄올 추출물을 이용하여 항산화 활성 및 뉴라니미데이즈 억제 효과를 조사하였다. 헥산, 에틸아세테이트, 메탄올과 70% 에탄올 조추출물에서 항산화력의 IC₅₀값을 비교한 결과 70% 에탄올 추출물이 DPPH 라디칼 소거능, ABTS 라디칼 소거능에서 각각 83.2±2.7, 85.6±2.4 μg/ml으로 가장 높았고, 뉴라니미데이즈 억제활성 IC₅₀값을 비교한 결과 메탄올 추출물에서 1.8±0.1 μg/ml로 나타났다. 또한 황금찰수수 추출물에서 컬럼크로마토그래피와 UPLC-PDA-MS/MS 분광기 분석을 통해, Gallic acid (1), Protocatecuic acid (2), p-Hydroxy benzoic acid (3), Vanillic acid (4), Caffeic acid (5), Ferulic acid (6), Luteolinidin (7), Apigeninidin (8), Luteolin (9), 총 9종의 폴리페놀 화합물을 확인하였다. 또한 각각의 화합물에 대한 항산화력의 IC₅₀값을 비교한 결과 Luteolinidin이 DPPH 라디칼 소거능, ABTS 라디칼 소거능에서 각각 10.9±0.5, 8.6±3.0 μM로 가장 우수 하였고, 뉴라니미데이즈 억제활성은 Luteolin이 12.9±3.8의 IC₅₀값과 비경쟁적 저해모델을 보였다. 결과적으로 황금찰수수는 높은 항산화 효과와 뉴라미니데이즈 억제활성을 보여 식품, 사료 등의 새로운 기능성소재로 다양하게 활용될 수 있음을 시사한다.

• 생명과학회지
• /
• 제22권11호
• /
• pp.1456-1462
• /
• 2012

소라페닙은 멀티카이네즈 억제제로서 신세포암, 전이성 간세포암 환자의 치료에 효과가 입증된 경구용 항암제이다. 이 연구의 목적은 고속액체크로마토그래피 텐덤질량분석기법(LC/MS/MS)을 이용하여 사람 혈장 내 소라페닙의 농도를 측정하는 효율적인 방법을 개발하고 한국식품의약품안전청(KFDA) 기준에 따라 분석법을 검정하는 것이다. 혈장시료($100{\mu}l$)에 내부표준물질인 chlorantraniliprole을 첨가한 후 이소프로필알콜과 에틸아세테이트로 구성(1:4, v/v)된 0.1% 포름산 함유 추출용액을 혼합하였다. 원심분리 후 상층액을 취하여 원심감압농축하였다. 잔사를 이동상에 재용해하고 Waters사의 역상 XTerra$^{TM}$ C18 칼럼(입자크기 $3.5{\mu}m$)을 장착한 고속액체크로마토그래피 장치에 주입하였다. 액체크로마토그래피는 0.1% 포름산과 10 mM 암모늄 포메이트를 함유한 버퍼용액과 메탄올, 아세토나이트릴을 각각 1:6:3으로 혼합한 용액을 이동상으로 사용하였으며 5분 내에 측정을 완료하였다. 분석대상 물질들은 텐덤질량분석기에서 electrospray 양이온 이온화($ES^+$) 검출방식으로 확인하였으며 소라페닙은 'm/z 465.2 ${\rightarrow}$ 252.5', chlorantraniliprole은 'm/z 484.4 ${\rightarrow}$ 286.2'으로 구성한 multiple reaction monitoring 방법을 사용하였다. 검정 결과, 2-5,000 ng/ml의 농도 구간에서 양호한 직선성($r^2$ > 0.99)과 정확도(90.7-103.9%), 정밀도(10% 이하)를 나타내었다. 새롭게 개발된 LC/MS/MS을 이용한 사람 혈장 내 소라페닙의 농도 측정법은 KFDA 기준을 만족하였으며, 기존의 방법에 비해 민감도가 높은 방법이었다.

• 한국식품영양과학회지
• /
• 제40권5호
• /
• pp.625-634
• /
• 2011

본 연구는 녹차씨껍질 분획 추출물 중 염증 저해능이 강력한 EtOAC분획을 선정하여 대식세포주인 RAW264.7 macrophage cell에서 항염증효과의 기전을 생화학적, 분자학적수준에서 분석하고자 하였다. 녹차씨껍질 추출물 100 mg당 총 페놀함량은 EtOAC분획에서 가장 높은 수준이었으며 EtOH추출물>PE분획>BuOH분획과 $H_2O$분획의 순으로 나타났다. 또한 EtOAC분획의 NO 억제능이 가장 강한 것으로 나타나, EtOAC분획의 polyphenol을 분석한 결과 EGC ($1146.5{\pm}11.01\;{\mu}g/g$)> tannic acid($967.0{\pm}32.24\;{\mu}g/g$)> EC ($70.9{\pm}4.39\;{\mu}g/g$)> gallic acid($947.6{\pm}1.03\;{\mu}g/g$)> caffeic acid($37.7{\pm}1.46\;{\mu}g/g$)> ECG($35.5{\pm}3.19\;{\mu}g/g$)> EGCG($15.5{\pm}0.09\;{\mu}g/g$)의 순으로 나타났다. 녹차씨껍질 EtOAC분획이 RAW264.7 macrophage cell에서 LPS 처리에 의한 산화적 스트레스로 발생되는 NO 생성을 농도 의존적으로 감소시키며($IC_{50}$: $80.11\;{\mu}g/mL$) $PGE_2$의 생성을 억제하였다. 염증생성 전사인자인 iNOS의 유전자 발현은 농도 의존적으로 억제시켰으나 COX-2의 단백질 발현에는 영향을 미치지 않았다. 녹차씨껍질 EtOAC분획은 총 항산화능과 GSH 수준을 증가시켜 산화적 스트레스를 경감시키는 역할을 하며 항산화효소계인 catalase, GSH-red 및 Mn-SOD 활성의 단백질 발현을 증가시키는 것으로 나타났다. 핵에서의 p65 농도는 대조군에 비해 녹차씨껍질 EtOAC분획을 처리한 군에서 현저하게 낮은 것으로 나타났다. 이상의 결과에서, 녹차씨껍질 EtOAC분획은 NF-${\kappa}B$ 활성을 억제함으로써 iNOS 단백질 발현을 억제하여 NO의 생성을 감소시키고 총 항산화능과 GSH 수준을 증가시키며, 항산화 효소계를 활성화시켜 세포내 산화적 스트레스를 감소시킴으로써 LPS 자극에 의한 염증반응을 지연하거나 억제하는 것으로 사료된다.

• 한국식품영양과학회지
• /
• 제30권6호
• /
• pp.1177-1183
• /
• 2001

결명자 에탄올추출물이 알코올을 투여한 흰쥐의 간손상에 미치는 영향을 알아보기 위해, 정상군, 결명자 에탄올추출물(200 mg/kg)투여군, 알코올 투여군(35% ethanol 10 mL/kg, b.w./day), 알코올 및 결명자 에탄올추출물(200 mg 및 400 mg/kg) 병합투여군 등 5군으로 나누어 6주간 사육후 체중증가율, 식이효율 및 혈액중 총 콜레스테롤, HDL-콜레스테롤 및 LDL-콜레스테롤농도, 혈청중 ALT 및 AST활성, 간손상 억제 효과를 확인하기 위해 유리 기 해독계 효소인 SOD, catalase, GSH-Px등의 활성과 유리기 생성계 효소인 XO활성을 측정하고, 지질과산화물인 TBARS 및 GSH함량에 미치는 영향을 관찰하였다. 1) 각 분획구의 항산화력은 n-핵산>클로르포름>에틸아세테이트>물>메탄올 순이었다. 2) 결명자 에탄올추출물과 알코올을 병합투여하므로서 체중증가율은 알코올만을 투여한 군에 비하여 유의적인 변화는 아니었으나 증가되는 경향을 보였으며 식이효율은 정상군의 치에 근접하게 증가되었다. 3) 간 손상의 지표의 하나인 혈청 중 ALT 및 AST활성의 경우, 알코올 투여로 정상군에 비하여 유의적으로 증가되었으나 결명자 에탄올추출물을 병합투여하므로서 정상군보다 오히려 낮았다. 4) 알코올 투여로 총 콜레스테롤 및 LDL-콜레스테롤함량은 정상군에 비하여 많이 증가되었으나 결명자 에탄올추출물 병합투여로 투여량이 증가됨에 따라 더욱 우수한 감소효과를 나타내었다. 반면 HDL-콜레스테롤함량은 알코올 투여로 정상군에 비하여 유의적으로 감소되었으나 결명자 에탄올추출물 병합투여로 정상군의 농도에 근접하게 증가되었는데, 특히 결명자 에탄올추출물만을 투여한 군의 함량이 정상군보다 높았다. 5) 결명자 에탄을 추출물이 알코올 투여로 상승된 유리기 생성계효소인 XO활성은 알코올만을 투여한 군에 비하여 약 42%정도 현저하게 감소시켰으나, 유리기 해독계 효소인 SOD, catalase 및 GSH-Px 활성에는 유의한 영향을 미치지 못했다. 6) 알코올 투여로 증가된 간 중의 TBA반응성 산물량을 결명자 에탄올추출물이 유효하게 감소시켰으며, 특히 결명자 에탄올추출물만을 투여한 군의 간 TBA반응성 산물량이 정상군보다 오히려 낮았다. 7) 알코올 섭취로 간조직 중의 GSH함량이 정상군에 비하여 약 51%정도 감소되었으나 결명자 에탄올추출물투여로 정상군의 함량에 근접하도록 증가되었다. 이상의 실험 결과에서 결명자 에탄올추출물의 항산화작용은 주로 알코올투여로 증가된 유리기 생성계 효소인 XO활성 억제와 비효소적 항산화작용을 나타내는 GSH함량을 증가시키므로서 지질과 산화물에 대한 방어력이 증강되어 나타난 결과로 여겨지고, 또한 혈청 중 지질함량, ALT 및 AST의 활성을 유의성 있게 감소시켰음은 결명자 에탄올추출물이 알코올에 의한 지방 간 또는 손상된 간세포를 회복시키는 작용이 있는 것으로 추정된다.

• 한국식품과학회지
• /
• 제44권6호
• /
• pp.763-771
• /
• 2012

본 연구에서는 싸리나무의 부위별 항산화활성을 검토하기 위하여 각 부위별 물, 50, 70, 100% 에탄올 용액과 열수추출조건을 이용하여 얻은 추출물의 DPPH 및 ABTS 라디칼 소거능, 총 페놀성 화합물의 함량을 비교분석하였다. 싸리나무 잎의 경우 70% 에탄올 수용액, 줄기 및 뿌리의 경우는 50% 에탄올 수용액을 이용하여 추출하는 것이 높은 추출수율을 나타내는 경향을 나타내었다. 부위별 추출조건에 따른 DPPH 라디칼 소거력을 분석한 결과는 싸리나무 잎의 경우 70% 에탄올 추출물이 높은 라디칼 소거능을 나타었으나, 추출용액의 에탄올 비율에 따른 유의적인 차이는 나타나지 않았다. 줄기 및 뿌리의 경우에는 50% 에탄올 추출물이 가장 우수한 DPPH 라디칼 소거능을 가지는 것으로 확인할 수 있었다. 각 부위별 물 추출물은 에탄올 수용액을 이용한 추출물에 비하여 낮은 라디칼 소거능을 보였으며, 열수추출조건에 얻은 추출물의 라디칼 소거능은 물 추출물에 비하여 소거능이 증가하는 것을 확인할 수 있었다. ABTS 라디칼 소거력을 분석한 결과는 싸리나무 잎의 경우 100% 에탄올 추출물이 다른 추출조건에서 얻은 추출물에 비하여 우수한 라디칼 소거능을 나타내는 경향을 보였으며, 줄기 및 뿌리의 경우에는 50% 및 70% 에탄올 추출물이 우수한 라디칼 소거능을 가지는 것으로 확인할 수 있었다. 각 부위별 물 추출물은 제일 낮은 라디칼 소거능을 보였으며, 열수추출에 의해 얻은 추출물의 ABTS 라디칼 소거능은 물 추출물에 비하여 증가하는 것으로 나타났다. 각 부위별 총 페놀성 화합물 함량을 분석한 결과 50% 에탄올 추출물이 가장 높은 페놀성 화합물의 함량을 가지는 경향을 보였으며, 물 추출물의 페놀성 화합물의 함량은 감소하는 것으로 분석되었다. 또한 열수추출에 의해 페놀성 화합물의 함량이 증가하는 것을 확인 할 수 있었다. 싸리나무의 부위별 유기용매를 이용하여 얻은 분획물의 항산화 활성을 분석한 결과 잎, 줄기 및 뿌리 부위에서 에틸아세테이트 분획물에서 가장 높은 DPPH 및 ABTS 소거능을 보였으며, 각 부위는 동일한 경향으로 부탄올 분획물 > 클로로포름 분획물 > 물 분획물 순으로 라디칼 소거능이 우수한 것으로 나타났다. 싸리나무의 경우 식품소재로 이용이 가능한 잎 부위를 이용하여 항산화 유효물질을 확인하기 위한 antioxidant asssay-guided isolation을 실시하였으며, 가장 라디칼 소거능이 우수한 분획인 LBFR1에서 compound 1을 분리하였다. 이의 화학적 구조를 $^1H$ 및 $^{13}C$ NMR, MS를 이용하여 분석한 결과 플라보노이드 화합물인 eriodictyol로 동정할 수 있었다. 분리한 eriodictyol의 DPPH 라디칼소거능을 분석한 결과 $EC_{50}$은 $5.98{\mu}g/mL$로 분석되었으며, ABTS 라디칼 소거력 분석을 통해 TEAC value는 0.7881로 분석되어 높은 항산화활성을 가지는 것을 확인 할 수 있었다. 또한 싸리나무 잎에 함유되어 eriodictyol의 함량을 HPLC를 이용하여 분석한 결과 10.50 mg/g of dry weight 으로 분석되어 잎에 함유되어 있는 플라보노이드 화합물을 이용한 기능성 소재로 개발 가능성을 기대 할 수 있었다.

• 한국식품과학회지
• /
• 제44권4호
• /
• pp.441-446
• /
• 2012

본 연구에서 추출 용매의 선택은 작두콩과 대두, 서리태의 추출 수율과 실험의 용이성 등을 고려하여 메탄올을 사용하여 실험을 진행하였다. 작두콩의 화학적 특성을 알아보기 위해 일반성분 중 수분, 회분, 조단백질, 조지방 실험을 하였으며, 이 중 조지방에서 서리태, 대두와는 다른 작두콩만의 특징을 찾을 수 있었다. 작두콩의 조지방 함량은 1.2%로 서리태와 대두의 조지방 함량 16.1, 16.5%와 비교해 볼 때 매우 낮음을 알 수 있었다. 이 낮은 조지방 함량으로 인해 비극성 유기용매 헥산이나 에틸아세테이트 등에서 추출 수율이 서리태나 대두에 비해 낮게 나타났다. 구성아미노산은 함량과 구성비율을 실험하였다. 그 결과 Histidine의 구성비율이 서리태(2.9%)나 대두(3.0%)와 비교해 볼때 9.2%로 상대적으로 높은 구성비율을 나타냈다. 콩에서 대표적인 항산화활성 물질로 알려진 이소플라본은 작두콩에서 검출되지 않았다. 작두콩과 대두, 서리태의 비타민 실험결과는 모두 비타민 C의 함량이 비타민 A의 함량보다 높게 검출되었다. 무기질 함량 실험에서는 작두콩과 대두, 서리태에서 10가지 무기질 중 칼륨, 칼슘, 마그네슘의 함량이 높게 나타났다. 총 폴리페놀은 대두 1,165.7 mg/100 g, 서리태 1,298.6 mg/100 g, 작두콩 1,152.0 mg/100 g으로 서리태 보다는 적지만 대두와는 유의적 차이를 보이지 않았다. 총 플라보노이드는 대두 71.8 mg/100 g, 서리태 97.5 mg/100 g보다 작두콩에서 유의적으로 높게(493.2 mg/100 g) 나타났다. DPPH 라디칼 소거활성 결과를 토대로 $SC_{50}$ 값을 구한 결과 ${\alpha}$-tocopherol(8.3 ${\mu}g/mL$)과 대등한 13.1 ${\mu}g/mL$로 항산화활성이 높게 나타났으며, 농도 의존적으로 활성이 증가하고 있음을 알수 있었다. 이상의 결과 같은 콩과의 식물이지만 대두나 서리태와는 다른 화학적 특성을 가지고 있고 높은 항산화활성을 갖는 작두콩의 식품이나 건강기능식품으로서의 활용가치를 확인할 수 있었고, 항산화활성 물질의 분리 등 더 많은 연구가 필요할 것으로 생각된다.

• 생명과학회지
• /
• 제25권4호
• /
• pp.433-440
• /
• 2015

호두껍질을 둘러싸고 있는 과피는 식품으로서 효율성이 떨어지지만, 생리활성물질로서 항산화 및 항균효과의 가치를 지니고 있다. 본 연구에서는 호두(Juglans regia L.)의 열매과피를 5종류 용매(methanol, n-hexane, ethyl acetate, n-butanol)로 추출하여 6종 추출물(MeOH Ex, Hexane Ex, CHCl₃ Ex, EtOAc Ex, BuOH Ex, Water Ex)을 얻어, 총 폴리페놀과 총 플라보노이드함량을 특정하고, 항균 및 항산화 활성을 시험하였다. 각 추출물의 항균 활성 은 병원균 8종에 대해 최소억제농도를 한천희석법으로 측정하였고, 항산화 활성은 DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl)와 ABTS (2,2’-azino-bis-(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonate)) 라디칼 소거능을 측정하여 EC₅₀ 값으로 평가하고, 총 플라보노이드 및 페놀함량과 상관관계를 분석하였다. 호두추출물 가운데 항균활성이 가장 우수한 것은 에틸아세테이트 추출물(EtOAc Ex)로서 Staphylococcus aureus SG511에 대해 3.2 mg/ml의 MIC을 나타내었 다. 또한, EtOAc Ex는 DPPH 및 ABTS 라디칼 소거 활성 EC₅₀ 값이 13.43 μg/ml과 41.83 μg/ml로 각각 나타내어 가장 우수한 항산화 활성을 보였다. 이러한 EtOAc Ex의 총 플라보노이드 및 페놀 함량은 각각 2.48 mg QE/g 및 223.25 mg GAE/g였다. 특히 총 페놀함량과 항균활성 및 항산화 활성은 양의 상관관계가 있어 추출액 속에 페놀함량이 높으면 생리활성도 높은 것이 확인되었다. 결론적으로 호두의 과피는 우수한 천연 항균 및 항산화 물질이 포함된 소재로서 이용 가능성을 제시한다.

• 한국식품영양과학회지
• /
• 제38권4호
• /
• pp.502-508
• /
• 2009

Paper disc법을 통하여 항균력을 측정한 결과, 물 추출물에서는 항균효과가 나타나지 않았으나, 4 mg/mL 농도의 에탄올 추출물에서는 그람 음성균 중 S. liquefaciens, S. Typhimurium 및 P. aerogenosa에 대해 항균효과를 보였으며, 실험에 사용된 모든 그람 양성균에 대해 항균효과를 보였다. 특히, B. subtilis, C. perfringens 및 L. monocytogens에 대해 높은 항균력을 보였다. 또한 A. niger 및 P. expansum에는 항진균 효과가 없었으나 S. cerevisae에 대해서는 4 mg/mL 농도에서 항진균 활성을 보였다. 지충이 에탄올 조추출물에 대한 MIC test를 실시한 결과, 그람 음성균에 대한 MIC 값은 $0.6{\sim}0.8%$로 약한 항균활성을 보였으나, 그람 양성 균주 중 C. perfringens와 L. monocytogenes에 대해서는 0.01 및 0.1%에서 두 균주의 생육을 효과적으로 억제하였다. 열 및 pH 안정성 실험 결과, 지충이 에탄올 추출물은 $121^{\cir}C$에서 15분간의 열처리와 pH $2{\sim}8$ 처리에도 항균활성에 변화가 없어 이들 추출물 유래의 항균물질은 열 및 pH 변화에 안정한 물질임을 알 수 있었다. 지충이 에탄올 추출물의 silica gel column chromatography 분획물을 2개 또는 3개씩 1:1(또는 1:1:1)의 비율로 혼합한 후 항균력을 측정한 결과, 클로로포름 및 에탄올 분획 혼합물과 클로로포름, 에틸아세테이트 및 에탄올 분획 혼합물에서 조 추출물 이상의 항균활성이 나타났다.