• 한국수산과학회지
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• 제19권6호
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• pp.537-546
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• 1986

고등어 유문수조직중에 분포하는 알칼리성단백질분해효소의 정제조건을 검토하고 염석, DEAE-Sephadex A-50 칼럼 크로마토그래피 및 Sephadex G-100 겔 여과에 의해 3종류의 알칼리성단백질분해효소의 분리${\cdot}$정제방법을 확립하였다. 유문수조직중에 분포하는 알칼리성단백질분해효소의 추출용매는 $1\%$ NaCl 용액이 가장 효과적이었다. 정제된 가칭 Enz, A, B 및 C의 각 알칼리성단백질분해효소는 전기영동적으로 균질함이 증명되었으며, 조효소에 비해 고유활성이 Enz. A는 34배, B는 53배 그리고 C는 37배로 각각 증가하였다. 각 효소의 수율은 조효소에 대해 $1.6\%,\;2.1\%$ 및 $1.5\%$였고, 총수율은 $5.2\%$였다.

• 한국미생물·생명공학회지
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• 제17권6호
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• pp.545-551
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• 1989

알칼리성 Bacillus속 8-16 균주의 내열ㆍ알칼리성단백질 분해효소를 정제하여 그 특성을 조사하였다. 본 균주의 알칼리성 protease를 아세톤침전, CM-셀룰로즈크로마토그래피, Sephadex G-100 및 G-75 젤 여과법으로 정제하였고 비활성이 37배되게 하여 단일단백질이 될 때까지 순수정제하였다. 이 효소는 7$0^{\circ}C$ pH 11에서 pH 12 사이에서 최대 활성을 나타냈고 6$0^{\circ}C$에서는 한시간 동안 안정하였다. 이 효소의 $K_m$치는 1.3mg/$m\ell$이며 분자량 33,000으로 추정된다. 또한 이 효소는 Cu$^{2+}$ 및 Mn$^{2+}$에 의해서 약간 활성화되고 Ag$^+$, Hg$^{2+}$ 및 PMSF에 의해서 저해되므로 활성부위에 serine기가 관여하는 것으로 추정된다.

• 미생물학회지
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• 제46권4호
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• pp.383-388
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• 2010

알칼리성 단백질 분해효소 고생산 돌연변이 균주 Vibrio metschnikovii L12-23, N4-8, KS1으로부터 알칼리성 단백질 분해효소를 암호화하는 vapK (Vibrio alkaline protease K) 유전자들을 PCR에 의하여 분리한 다음 DNA shuffling, error-prone PCR 방법과 같은 분자진화 기술을 통해 고활성 단백질 분해효소를 생산하는 재조합 V. metschnikovii 균주를 제작하였다. DNA shuffling 방법을 통해 변형시킨 vapK-1 유전자와 이 유전자를 주형으로 error-prone PCR 기법을 통해 재 변형된 vapK-2 유전자를 cloning한 후 V. metschnikovii KS1 균주에 역도입하여 재조합 균주를 제조하였다. 재조합 균주들의 단백질 분해 능력을 조사한 결과 vapK-2 유전자가 2 copy 도입된 재조합 균주의 경우 야생형 균주인 V. metschnikovii RH530에 비해 43.6배 높은 단백질 분해활성을 보였으며 숙주인 V. metschnikovii KS1에 비해 약 3.9배 향상된 단백질 분해 활성을 확인할 수 있었다. 변형된 vapK-1과 vapK-2 유전자를 야생형 vapK 유전자의 염기서열을 비교 분석한 결과 단백질 분해 능력의 활성에 영향을 미치는 active site를 제외한 부분에서 변화가 일어났음을 확인 할 수 있었다. 변형된 유전자 vapK-1을 two copy를 포함한 재조합 플라스미드를 가진 V. metschnikovii KS1을 30 L fermentor로 배양 하였을 때 배양 후 35 시간에 18,000 PU/ml의 활성을 보였으며, 이는 향후 산업용 균주로서 사용될 수 있는 가능성을 제시하였다.

• 한국수산과학회지
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• 제19권6호
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• pp.521-528
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• 1986

고등어와 정어리의 각 장기조직에 분포하는 단백질분해효소의 최적활성조건을 분석${\cdot}$비교하고, 열안정성과 저온저장중의 활성의 변화 등을 검토한 결과를 요약하면 다음과 같다. 1. 고등어와 정어리의 각 장기에서 단백질분해효소를 추출하여 pH에 따른 단백질분해능을 분석한 결과, 소화관, 췌장, 유문수 및 비장은 알칼리성에서, 위는 산성에서, 그리고 간은 산성, 중성 및 알칼리성의 세 영역에서 각각 단백질분해능이 있음을 알았다. 그리고, 소화기관인 위, 췌장, 및 유문수에서 추출한 조효소는 활성이 높았으나, 간 및 비장에서 추출한 조효소는 활성이 아주 낮았다. 2. 각 장기에서 추출한 단백질분해효소의 열안정성을 분석한 결과, 두 어종의 위와 유문수 및 정어리의 췌장에서 추출한 효소의 내열성이 가장 약했으며, 비장과 간에서 추출한 중성단백질분해효소는 내열성이 강한 것으로 판단되었다. 3. 각 장기에서 추출한 조효소의 저장성을 검토한 결과. $5^{\circ}C$ 저장시 두 어종의 유문수와 고등어의 췌장${\cdot}$위 및 비장에서 추출한 효소는 안정성이 높았으며, 그 이외의 조직에서 추出한 효소는 저장 28일까지 많은 실활이 일어났다. 또한 방부제 sodium azide에 의한 영향은 어종과 조직에 따라 미미한 차이를 보였으며, $-15^{\circ}C$에서 저장한 경우가 $5^{\circ}C$에 저장한 경우보다 효소의 실활이 더욱 컸다.

• 미생물학회지
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• 제51권1호
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• pp.75-80
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• 2015

동해에서 분리된 Pseudoalteromonas donghaensis HJ51는 체외분비 단백질 분해효소를 생산하는 신종 미생물로 보고되었다. 체외 단백질 분해효소의 특성과 최적 생산 조건을 결정하기 위해 crude supernatant을 사용하여 단백질 분해효소의 최적 활성 온도와 pH를 조사한 결과 $40^{\circ}C$와 pH 7.5-10.5이었으며, pH 11에서도 88%의 높은 상대적인 효소 활성을 나타내었다. 효소의 금속 요구성을 조사한 결과, $Fe^{3+}$를 10 mM로 첨가하였을 때 최대 효소활성 증가를 보였다. 최대의 효소생산 조건을 탐색한 결과, 기본배지인 PY-ASW (peptone 0.5%, yeast extract 1.0%, artificial seawater)에 탄소원을 첨가하지 않는 것이 가장 높았으며, 질소원으로는 peptone 보다 beef extract, tryptone, casmino acids을 각각 첨가했을 때 활성이 21, 7, 4% 증가하였다. 이러한 결과를 종합해 볼 때 P. donghaensis HJ51이 생산하는 효소는 알칼리성 pH 환경 및 저온환경에서 활성이 필요한 분야에 응용이 가능할 것으로 사료된다.

• 한국식품영양학회지
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• 제19권4호
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• pp.496-501
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• 2006

본 연구는 대한민국 서해안 갯벌로부터 알칼리성 단백질 분해 효소를 생산하는 세균을 분리하고 분리된 세균으로부터 생산되는 단백질 분해 효소의 생화학적 특징을 조사하는 것이다. 분리 균주는 16S rRNA의 염기 서열, 그람 염색과 전자 현미경사진을 통해 Celidibacter sp. HK-1으로 명명하였다. 분리 균주의 증식과 pretense 생산을 위한 최적 온도는 $25^{\circ}C$이었다. 분리 균주의 증식은 접종 10시간후에 stationary phase에 도달하였다. 효소 생산은 14시간 후 최대 값을 보였다. 효소 활성의 최적 온도와 pH는 각각 $45^{\circ}C$와 pH 9이었다. Pretense의 분자량은 약 50KD이었고 pretense의 부분적인 아미노산 서열은 Ala-Try-Ala-Leu-Asn-Thr-Ser-Val-Thr-Glu-Thr-Phe-Ala-Lys이었다. Protease의 부분적인 아미노산 서열은 Streptomyces avemitilis의 pretense와 높은 상동성을 보였다.

• 생명과학회지
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• 제20권11호
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• pp.1656-1661
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• 2010

난황단백질 가수분해를 위한 알칼리성 단백질분해효소를 5가지 담체 Duolite A568, Celite R640, Dowex-1, Dowex 50W 그리고 Silica gel R60 에 고정화하였다. Duolite A568의 경우에 24.7%의 최대 고정화 효율을 나타내었다. 자유 효소와 고정화 효소에 대한 최적의 pH는 각각 8과 9였고, 최적의 pH는 고정화에 의해 염기성으로 1만큼 증가하였다. 그러나 최적 온도는 자유 효소와 고정화 효소 모두 $50^{\circ}C$로 같았다. 고정화 효소가 자유 효소에 비해 높은 열 안정성을 보였다. 재사용 회분식 공정에서 10 cycle 동안 효소활성은 초기 활성의 86%를 유지하였다. 연속 공정을 위한 충진층 반응기에서 여러 유속에 대한 장기 조업에서 효소 활성의 안정성 평가하였는데 낮은 유속일수록 높은 활성을 유지하였다. 연속 조업에서 casein과 난황 단백질을 사용하여 원료에 대한 고정화 효소의 활성에 대한 영향을 조사하였다. 96시간 연속 조업에서 casein의 경우는 초기 활성의 83%를 유지하였고 난황 단백질의 경우는 초기 활성의 61%를 유지하였다.

• 한국식품조리과학회지
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• 제11권1호
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• pp.26-32
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• 1995

본 실험은 두유에 칼슘을 강화하기위한 사전실험으로 두유단백질을 단백분해효소로 처리한 뒤 효소처리 전, 후에 나타나는 단백질의 기능적 특성을 비교 분석하였다. 두유단백질과 단백분해효소의 비율이 100 : 1이 되도록 첨가하여 pH7.5, 5$0^{\circ}C$에서 10분간 처리하였다. pH에 따른 용해도는 두유단백(SMP)과 분리대두단백 (SPI)인경우 pH4.7에서 최소를 보이고 산성 및 알칼리성으로 갈수록 증가하였으나 전반적으로 매우 낮게 나타난 반면 효소처리된 두유단백질(PT-SMP)은 전 pH범위에서 SMP에 비해 높은 용해도를 보였고 특히 pH4.7에서는 20배 정도의 높은 용해도를 나타내었다. pH에 따른 유화력은 3가지 시료 모두 용해도와 같은 패턴으로 pH4.7에서 최소를 보이고 산성 및 알칼리성으로 갈수록 증가하는 경향을 나타내었다. SMP와 SPI는 높은 유화력을 나타냈으며 PT-SMP도 이와 유사한 정도의 유화력을 나타내었다. 반면 PT-SMP의 유화안정도는 다소 낮게 나타났다. SMP와 SPI는 pH4.7에서 최소의 거품형성력을 나타내면서 그 외의 pH에서는 약간 증가하다가 pH 12에서는 높은 거품형성력을 보여주었다. PT-SMP는 pH2와 4.7에서 높은 거품형성력을 나타내었고 pH8까지 차츰 감소하다가 pH12까지 다시 증가하였다. 거품안정성은 3가지 시료 모두 30분까지 급격한 감소를 보이다가 차츰 감소정도가 완만하게 나타났다. SMP와 SPI는 pH4.7에서 비교적 높은 안정도를 보였고 pH 12에서는 가장 낮은 안정도를 보였다. PT-SMP는 모든 pH에서 다른 두시료에 비해 낮은 안정도를 나타내었으나 pH4.7에서는 다소 높은 안정도를 나타내었다. PT-SMP는 SMP에 비해서 pH4.7을 제외한 pH에서 높은 열응고성을 나타내었고 가열후 감소된 가용성 단백질의 양을 보면 모든 pH에서 PT-SMP가 높게 나타났다. 이상의 결과로 볼 때 두유단백질에 효소처리를 하게 되면 높은 용해도와 거품형성력, 또 비슷한 정도의 유화력을 나타냄을 알 수 있다. 특히 산성 pH에서 월등한 용해도와 거품형성력을 나타내어 효소처리하여 부분가 수분해된 두유에 과일을 첨가하는 것도 가능하리라 생각되며, 또 효소처리된 두유단백질이 청량음료나 마요네즈, 과일첨가후식의 첨가물로 사용될 때 높은 기능적 특성을 발휘하리라 사료된다.

• 농업생명과학연구
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• 제45권6호
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• pp.201-212
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• 2011

인천 연안의 심하게 오염된 갯벌로부터 강력한 세포외 알카리성 단백질 분해효소를 생산하는 호알카리성 Bacillus clausii I-52를 분리하였으며, 이 균주로부터 알카리성 단백질 분해효소의 유전자를 cloning하여 서열 분석을 하였다. Chromosome 서열이 완전히 밝혀진 Bacillus subtilis의 서열을 기초로 하여 알카리성 단백질 분해효소 및 promoter를 포함하도록 primer를 고안하여 PCR을 수행하여 2,277 bp의 DNA 단편을 얻었으며 BLAST 분석 결과 29 개의 아미노산으로 이루어진 signal peptide, 77 개의 아미노산으로 이루어진 propeptide 및 275 개의 아미노산을 갖는 활성형의 BCAP으로 구성된 총 381 개의 아미노산을 코딩하는 1,143 bp의 open reading frame을 확인하였다. 활성형 BCAP의 N-말단 아미노산은 Ala이며, 분자량 및 pI 값은 각각 27698.7 Da과 6.30으로 계산되었다. 아미노산 상동성을 분석한 결과, B. subtilis 유래의 nattokinase precursor 및 B. subtilis BSn5 유래의 subtilisin E precursor와 99%의 서열 상동성을 나타내어 B. clausii I-52 유래의 BCAP은 subtilisin 계열의 단백질 분해효소임을 확인하였다. E. coli BL21(DE3)에서 발현한 재조합 BCAP는 N-Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA 를 효율적으로 분해하였다. Refolding한 재조합 BCAP은 전형적인 serine protease inhibitor인 PMSF에 의하여 강하게 효소 활성이 억제됨으로써 serine protease 계열의 단백질 분해효소임을 알 수 있었다.

• 생명과학회지
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• 제23권12호
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• pp.1486-1494
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• 2013

Octopus vulgaris의 장관으로부터 단백질 가수분해력과 활성을 측정함으로서 높은 단백질분해효소 생성능을 가진 균을 분리하여 동정하였다. 균이 생성한 단백질분해효소는 황산암모늄침전, cellulose CM-52 양이온 교환 크로마토그래피, DEAE-Sephadex A50 음이온 교환 크로마토그래피의 3단계를 통해 정제하였다. 장관으로부터 분리한 균중 가장 높은 단백질분해효소 생성능을 가진 균은 Bacillus sp. QDV-3로 나타났으며 이균을 분리한 후 표현형 분석, 생화학적 특성, 16S rRNA 유전자염기서열분석을 통해 Bacteria역, Firmicutes문, Bacilli강, Bacillales목, Bacillaceae과, Bacillus속으로 Bacillus flexus와 99.2%의 유사성을 보이는 것으로 확인하였다. 균이 생성한 단백질 분해효소를 QDV-E로 지정하였으며 61.6 kDa의 분자량을 나타내었다. 이 효소는 pH 9.0~9.5에서 활성을 나타내었고 최적온도는 $40^{\circ}C$였으며 $50^{\circ}C$에서는 60분간 96% 이상의 활성을 보유하였다. Phenyl methyl sulfonyl fluoride (PMSF)에 의하여 활성이 억제 되었으므로 세린 알칼리성 단백 분해 효소인 것으로 결론지었다. 금속이온인 $Mn^{2+}$ 와 $Mg^{2+}$에 의하여 효소활성 상승효과를 보였으며 $Ba^{2+}$, $Zn^{2+}$, 그리고 $Cu^{2+}$에 의하여 활성이 억제되었다.