본 연구에서는 원유, 휘발유, 등유, 경유를 분해하면서 생물 계면활성제를 생산하는 균주인 B. subtilis JK-1을 선별하여 생물계면활성제 생산에 관한 연구를 수행하였다. 생물계면활성제 생산을 위한 최적 배지를 결정하기 위해 다양한 탄소원과 질소원, 무기염류를 조사하였다. B. subtilis JK-1은 탄소원인 1.0%(w/v) soluble starch와 질소원인 0.5% (w/v) skim milk를 포함한 배지에서 96 시간 동안 배양한 결과 가장 많은 생물계면활성제를 생산하였으며, 이 때 탄소원과 질소원의 비율은 2.0이었다. 그리고 0.1% (w/v)의 $KNO_3$는 생물계면활성제 생산을 위한 최적 무기염으로 확인되었다. B. subtilis JK-1은 LB 배지와 TSB 배지보다 본 연구에서 확립한 생물계면활성제 생산 최적 배지에서 더 많은 생물계면활성제를 생산하였다. 생물계면활성제 생산 최적 배지에서 B. subtilis JK-1 배양액의 표면장력은 균주 접종 후 48시간 만에 47.3 dyne/cm에서 24.0 dyne/cm로 감소하였다.
본 연구에서는 토양에 오염된 디이젤 성분을 제거하기 위한 토양세척 기술 중에서 적절한 계면활성제를 사용하여 토양입자에 결합되어 있는 유해 유기물질의 표면장력을 약화시켜 제거하는 기술을 이용하기 위해 생분해성이 우수하고 2차 오염문제가 없는 생물계면활성제를 생산하였다. Peudomonas aeruginosa ATCC 9027를 이용하여 생산된 생물계면활성제인 rhamnolipid와 기존에 사용되고 있는 화학계면활성제와의 디이젤 세척효능을 비교분석하였다. 회분식, 연속식 세척실험 결과 디이젤 오염토양 초기농도 5,000ppm에서 계면활성제 1%, 세척시간 24시간 경과 후 본 연구에서 생산된 rhamnolipid의 세척효율이 모두 약 95%로 사용된 계면활성제 중에서 가장 우수한 세척효율을 보였다. 화학계면활성제들은 대부분 50∼80% 미만의 세척효율을 나타내었으며, HLB값이 8에서 15사이에서의 화학계면활성제의 경우 75%이상의 분해효율을 나타내었다. 그러나, HLB값이 8이하이거나 15이상에서는 60%이하의 낮은 디이젤 분해효율을 나타내었다.
본 연구의 목적은 원유에 오염된 지역의 토양시료로부터 분리한 생물계면활성제 생산균주의 특성을 조사하기 위하여 실시하였다. 1% 원유를 포함하는 배지에서 균주 HK-3의 배양기간 동안, 생장, 생물계면활성제의 생산, pH의 변화 등을 조사하였다. 생물계면활성제의 생산능력이 뛰어난 균주인 HK-3를 선별하여, 이 균주의 배양기간에 따른 생장 변화와 생물계면활성제의 생산량, 그리고 pH에 대하여 관찰하였다. HK-3는 배양 36시간이 경과하였을 때, 가장 많은 양의 생물계면활성제를 생산하였다. 생물계면활성제 생산에 대한 부가탄소원의 효과를 알아보기 위하여 HK-3를 다른 부가탄소원(예, glucose, dextrose, mannitol, citrate, acetate)과 함께 배지에서 배양하였다. 그 결과, 생물계면활성제의 최대생산량은 mannitol을 포함하는 BH 고체평판배지에서 관찰되었으며, 투명대의 면적은 직경은 약 7.64 cm2로 측정되었다. 분리균주의 생리학적 및 생화학적 특성을 조사하였으며, 주사전자현미경을 통하여 불규칙한 막대형의 세균으로 관찰되었다. BIOLOG 시스템과 16S rRNA 염기서열을 이용한 계통유전학적 분석을 통하여 동정하여 Pseudoalteromons 종으로 확인되어 Pseudoalteromons sp. HK-3로 명명하였으며, GenBank에 [FJ477041]로 등록하였다.
생물계면활성제 생성균주, Pseudomonas aeruginosa F722를 이용하여 다양한 배양조건과 배지조성에서 생물계면활성제 생산성을 검토하였다. 질소원과 탄소원을 검토하기 전에는 P. aeruginosa F722의 생물계면활성제 생산량은 0.78 g/l이었다. 하지만, 질소원과 탄소원을 검토한 후에는 생물계면활성제 생산량이 2배 증가한 1.66g/l이었다. 무기질소원으로 $_NH4$Cl 또는 $NaNO_2$를 첨가하였을 때 생물계면활성제 활성에 효과적이었으며 유기질소원으로는 yeast extract 또는 tryptone을 첨가하였을 때 생물계면활성제 활성이 높았다. 이중 무기 질소원으로 0.05% $NH_4$Cl , 유기 질소원으로 0.1% yeast extract를 질소원으로 첨가하였을 때 가장 최적이었다. 탄소원으로 소수성 기질(n-alkane) 또는 친수성 기질(glucose, glycol)을 첨가하여 생물계면활성제 생산량을 조사하였는데 소수성 기질보다는 친수성 기질인 3.0% glucose를 첨가하였을 때 생물계면활성제 생산량이 높았다. 이때의 탄소원/질소원 비율은 17~20이었다. P. aeruginosa F722는 배양조건 3.0% glucose, 0.05% $NH_4$Cl, 0.1% yeast extract, $35^{\circ}C$, pH 7.0, C/N ratio 20, 5 days에서 생물계면활성제 생산량은 1.66g/l이였다. 질소원이 결핍 후 탄소원을 첨가하여 배양하였을 때가 질소원과 탄소원을 함께 첨가하여 배양했을 때보다 생물계면활성제 생산속도 및 균체 생장속도가 높았다. 최적 배양조건하에서 얻어진 배양액의 표면장력은 30mN/m이었다.
대전일원의 유류오염 지역의 토양에서 분리된, 생물 계면활성제 생성능이 우수한 Pseudomonas sp. G314균주 [23]가 생산하는 생물 계면활성제의 특성을 조사하고 그 성분을 확인하였다. Pseudomonas sp. G314가 생산하는 생물 계면활성제는 상온에서 10일 보관 후에도 26.2 dyne/cm 정도의 표면장력을 유지해 냉장 보관한 계면활성제와 비슷하게 안정하였고, 5 l 발효조를 이용한 배양에서 회분배양의 25 dyne/cm 보다는 약간 높은 27 dyne/cm 정도의 계면활성제를 생산해 대량 배양 할 수 있음을 확인하였다. 또 이 계면활성제는 acetone과 methanol에 잘용해 되고 benzene과 toluene에 약하게 용해되어 glycolipid 계열의 생물계면활성제임이 추정되었고[23], 이를 silica gel column을 통해 용출하고, TLC로 전개하여 확인된 Rf 0.58인 spot이 bial's reagent와 rhodamine 6G에서 양성반응을 나타내 Pseudomonas sp. G314가 생산하는 생물 계면활성제는 탄수화물과 지질이 함유된 glycolipid 계열의 생물 계면활성제임을 확인하였다.
Bacillus pumilus IJ-1의 생물계면활성제 생산을 위한 배지 조성의 특성을 조사하기 위하여 다양한 탄소원, 질소원 및 무기염이 미치는 영향을 검토하였다. 그 결과 B. pumilus IJ-1은 0.5%(w/v) tryptone을 첨가하여 배양하였을 때 가장 많은 생물계면활성제를 생산하였다. B. pumilus IJ-1은 0-10% (w/v)의 NaCl 농도와 pH 5-10, $20-45^{\circ}C$의 환경에서 생장이 가능하였다. 그리고 생물계면활성제 생산은 pH 9.0의 초기 배지에서 $20^{\circ}C$, 72시간 동안 배양했을 때 최대였으며, 이러한 배양 조건 하에서 얻어진 배양액의 표면장력은 27.0 dyne/cm이었다.
본 연구에서는 Bacillus subtilis JK-1의 생물계면활성제 생산을 위한 배양 특성을 조사하기 위하여 다양한 배양 온도와 배지의 pH, NaCl 농도에 따른 균주의 생장과 배양액의 pH, crude 생물계면활성제의 표면장력을 배양 시간대별로 측정하였다. B. subtilis JK-1은 $15-45^{\circ}C$와 pH 6-10, 0-10% (w/v) NaCl 농도의 환경에서 생장과 생물계면활성제 생산이 가능하였으며, 배양액의 pH는 중성 또는 약알칼리성으로 점차 변화 하였다. 생물계면활성제 생산은 pH 7.0의 초기 배지에서 $35^{\circ}C$, 48시간 동안 배양했을 때 최대였으며, 이 때의 표면장력은 24.0mN/m이었다. 그리고 배지 내 NaCl 농도가 0% (w/v)에서 10% (w/v)로 증가할수록 균주 생육도는 감소하였고, 최종 배양액의 pH는 약알칼리성에서 산성으로 변화하였으며, 표면장력 값은 증가하였다.
Candida sp. SY16의 휴식세포를 이용하여 탄소원만 포함되 있는 증류수로부터 많은 양의 생물계면활성제(mannosylerythritol lipid: MEL)를 생산할 수 있었다. 플라스크를 이용한 생산반응의 경우, 20 g/l의 휴식세포를 75g/1의 soybean oil이 포함되있고, pH는 4~5범위에서 반응할 때, 가장 높은 생산수율을 얻을 수 있었으며, 높은 농도($PO_4$-P 농도 198 $\mu\textrm{g}$/ml 이상)의 인은 MEL 생산을 저해하는 것으로 나타났다. 최적화된 조건으로 jar fermentor를 이용하여 휴식세포를 반응한 경우 생물계면활성제를 120 h 반응 후, 58 g/l로 얻을 수 있었으며, 그 생산성은 성장세포를 이용한 회분식 발효의 경우보다 높았고, 배양시간도 단축시킬 수 있었다.
본 연구에서 분리된 phenanthrene 분해균주의 대부분이 소수성을 나타내었고, 미생물계면활성제를 생산하면서 분해하는 균주보다 phenanthrene 분해능이 높았다. 균주 H6의 경우 phenanthrene 분해시 생산되는 미생물계면활성제는 포도당을 분해할 때도 생산되면 미생물의 성장과 더불어 증가하다가 stationary phase에서 일정하게 유지되었다. H6는 Bacillus subtilis로서 분리된 미생물계면활성제는 lipopeptide이었으며 H6에서 추출한 미생물계면활성제는 pH 2 이하에서 거의 회수되었고, 분산력이 Tween 80이나 Brij 30 등 화학계면활성제보다 높았고 열에 강한 특성을 보였다.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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