자생하는 미생물의 활성을 촉진시킴으로써 오염된 연안퇴적물을 현장생물정화하기 위하여 사용하는 미생물활성촉진제의 용출특성에 대한 연구를 수행하였다. 미생물의 생리활성을 촉진하는 황산염, 질산염을 오염되지 않은 연안퇴적물과 혼합하였으며, 혼합물을 볼 형태로 만든 뒤 셀룰로스 아세테이트 및 폴리설펀으로 각각 표면을 코팅하여 볼 형태의 미생물활성촉진제 2종을 제작하였다. 또한, 황산염과 질산염이 용해된 생리활성물질 용액에 입상활성탄을 침지시켜 입자상 미생물활성촉진제를 별도로 준비하였다. 셀룰로스 아세테이트로 코팅한 미생물활성촉진제를 전자현미경으로 관찰한 결과 코팅층 내부는 다소 큰 공극이 불규칙적으로 존재하였으나 코팅층 외부는 촘촘한 벌집모양의 공극들이 분포되어있었다. 폴리설펀으로 코팅한 미생물활성촉진제의 경우는 코팅층의 내부와 외부 모두 공극이 없는 치밀한 구조를 보였다. 셀룰로스 아세테이트로 코팅한 미생물활성촉진제의 생리활성물질 용출율은 폴리설펀으로 코팅한 미생물활성촉진제에 비해 증류수와 해수에서 모두 높았으며, 입자상 미생물활성촉진제로부터의 생리활성물질의 용출율은 폴리설펀으로 코팅한 미생물활성촉진제에 비해 약 9배 이상 높았다. 미생물활성촉진제로부터 생리활성물질들의 용출속도는 정체조건에 비해 난류조건에서 약 3배 이상 빠른 것으로 평가되었으며, 생리활성물질들 중에서 질산염은 황산염에 비해 빠르게 용출되는 특성을 보였다.
Rhizopus oryzae를 액체배양하는 동안, $\alpha$-amylase, acid phosphatase 그리고 alkaline phosphatase와 같은 분비효소의 분비능에 대한 계면활성 제의 촉진효과를 조사하였다. 그 결과 집락의 형태적인 변화를 볼 수 있었는바, 0.18mM SDS 처리구에서는 작은 pelletal형, 0. 48mM DOC 처리구에서는 pulpy형, 계면활성제를 처리하지 않은 시험구에서는 사상형의 집 락을 나타내었다. SDS를 첨가함으로써 $\alpha$-amylase는 9배, acid phosphatase는 25배의 활성도 증가가 유도되었다. DOC첨가 시험구에서 alkaline phosphatase 활성도는 배양액에서 11배 증가가 나타났을 뿐 아니라 세포질에서도 역시 상승하였다.
유류로 오염된 토양을 토양미생물 복원제를 첨가한 후 다양한 조건에서20일 동안의 유류저감효과를 알아보았다. 실험조건은 유류로만 오염된 토양(DS), 토양미생물 복원제를 20%(w/w)가 되도록 첨가한 유류로 오염된 토양(DSP), 토양 미생물 복원제를 넣은 후 pH를 중성으로 보정한 유류로 오염된 토양(DSP-1), 토양미생물 복원제와 촉진제를 넣은 유류로 오염된 토양(DSP-2), 토양미생물 복원제와 촉진제를 넣은 후 pH를 중성으로 보정한 유류로 오염된 토양(DSP-3)을 설정하였다. 실험 결과 pH를 보정한 토양미생물 복원제를 첨가한 유류오염토양은 탈수소 효소 활성과 TPH 저감에서의 효능이 우수하였다. 실험이10일 경과되었을 때 탈수소 효소 활성이 가장 높은 DSP-1 토양이 TPH 역시 가장 활발히 분해했다. 결과적으로 초기 10일의 배양기간 동안 토양미생물 복원제를 첨가한 토양은 대조군에 비해 38% 가량의 TPH 저감상승효과를 볼 수 있다. 토양미생물 복원제의 첨가를 통해 초기 저감속도를 올려줄 수 있으며, 최종적으로도 비 첨가군에 비해 높은 저감효율을 기대할 수 있다. 토양미생물 복원제를 유류오염토양을 복원한다면 초기 오염물질을 빠르게 처리할 수 있지만 미생물 활성은 pH, 온도 등 환경 인자에 많은 영향을 받으므로 토양미생물 복원제의 효율을 최대화하기 위해서는 환경 인자를 분석하여 이를 바탕으로 복원을 진행한다면 오염물질 정화 효율을 향상시킬 수 있을 것이다.
반추동물의 생산효율을 향상시킬 목적으로 반추위 환경을 조절하려는 노력들이 수십년간 지속되어 오면서 그동안 주로 사료급여 및 사양관리 시스템 개발(NRC, 2001)이 근간을 이루어 왔으나, 최근에는 유전공학, 효소공학, 생물공학, 미생물공학, 천연물화학 등의 발전으로 식물추출물, 항생제, 미생물제제, 계면활성제 등 다양한 분야에서 연구가 진행되고 있다 (Yang과 Russell, 1993; 이 등, 1997; Lee 등, 2003; Lee와 Ha, 2003; Busquet 등, 2006). 그 중, 계면활성제인 surfactant는 미생물 세포막 표면에 부착하여 미생물에 대한 산소공급을 차단함으로써 호기성 미생물 성장을 감소시키며 (Hulme와 Stranks, 1970), 세포내, 외의 효소를 유리시켜 효소기능 및 분비를 촉진 하는 것 (Reese와 Maguire, 1969; Munn 등, 1983; Yazdi 등, 1990)으로 알려져 있다. 이러한 surfactant의 작용원리를 이용하여 반추위내 혐기성 발효를 촉진시키기 위한 제제로서 그 가능성이 높이 평가되어 왔는데, 지금까지 반추위 발효 조절 기능이 밝혀진 계면활성제는 비이온성으로서 반추동물의 소화율과 생산성에 기여할 수 있는 제제로서 인정받고 있다. 계면활성제를 이용한 일련의 시험 중, 앞서 수행한 비이온성 계면활성제와 양쪽 이온성(+/-) 계면활성제를 이용한 시험에서 비이온성 계면활성제는 in vitro 반추위 발효양상에 매우 긍정적인 결과를 얻었으나 양쪽 이온성(+/-) 계면활성제는 반추위 미생물에 오히려 독성으로서 작용하는 결과를 얻었다(De Oude, 1992). 또한 양(+)이온성과 음(-)이온성 계면활성제에 대한 국내의 연구가 전무한 사항이라 참고 자료를 찾을 수가 없었다. 따라서 본 시험은 일반적으로 많이 사용하는 양(+)이온 또는 음(-)이온성을 띄는 계면활성제를 선발하여 반추위 발효 성상 및 미생물 합성에 어떠한 영향을 미치는지를 규명해 보고자 실시하였다.
오염된 토양 중 phenanthrene의 분해에 미치는 비이온계 계면활성제와 생물계면활성제의 영향을 살펴보았다. 비이온계 합성 계면활성제로 polyoxyethylene oreyl esterC$^{17}$ H$^{33}$ COO($C_2$$H_4$O)nH) 와 생물계면활성제인 sophorolipid를 적용하였다. 계면활성제의 농도, 수분함량, 접종균 처리 방법 및 종류, pH, 온도, 부가영양분 등의 변수들이 phenanthrene의 생분해에 미치는 영향을 비교실험 하였다. 계면활성제 농도가 CMC이하의 경우 계면활성제는 phenanthrene의 생분해성을 촉진하였으나, CMC 값 이상의 영역에서는 계면활성제가 미생물의 phenanthrene분해작용을 저해하였다. 30%의 수분함량과 pH 7, $30^{\circ}C$에서, 부가영양분으로 glucose를 10g/L수준으로 첨가하였을 때 좋은 분해도를 나타내었다. 충진제로 짚이 첨가되는 경우 토양 : 짚의 중량비가 5:2이고, 수분함량이 50%인 경우 phenanthrene의 분해가 촉진되었다.
토양내 atrazine 분해촉진을 위한 생물적 증진제로서의 토양내에서 직접증식된 Atrazine 분해 미생물을 함유하는 활성토의 효용성을 조사하였다. Atrazine 분해미생물을 증식시키기 위하여 Wooster silt loam을 4 mg/kg 농도의 atrazine으로 3회 연속처리하며 atrazine 분해 미생물 수와 atrazine 분해속도를 관찰한 결과, 1회 처리 후 atrazine 분해속도가 현저하게 증가하였고, 2회 처리 후 atrazine을 탄소원과 질소원으로 이용하는 미생물의 수가 각각 103, 101배 증가하였다. 증식된 미생물을 함유하는 이 활성토를 atrazine에 오염(초기농도4 mg/kg)된 Ohio의 전형적인 농지 토양에 0.5%비율로 접종하였을 때, 토양내atrazine 농도가 4일만에 초기농도의 2% 이하로 감소하였다. 비전형적인 토양(pH 4.5 또는 유기물함량 43%)에서 같은 효과를 얻기 위해서는 더 높은 비율의 접종이 필요하였다. 활성토는 저온($10^{\circ}C$ 이하) 습윤(수분함량 15%)한 상태에서 최소한 6개월간 안정하였다. 본 연구결과는 atrazine 분해미생물이 토양내에서 비교적 쉽게 증식되며, 이를 함유하는 활성토가 토양내에서의 atrazine 분해 촉진을 위한 접종제로 유용하게 이용될 수 있음을 보여준다.
오염물질이 처리된 해양저질을 이용하여 황산염, 질산염 및 아세테이트 등의 생물활성물질을 첨가하여 생물활성촉진볼을 제작하였으며, 셀룰로스 아세테이트 코팅(CA)과 폴리설펀 코팅(PS) 방법으로 표면을 처리하여 생물활성촉진물질의 용출율을 조절하고자 하였다. SEM 분석으로 평가한 생물활성촉진제의 형태적 특성은 CA의 경우, 내부코팅층은 비교적 큰 공극이 다소 존재하였으며, 외부 코팅층은 균일하고 촘촘한 벌집모양의 공극이 분포되어있었고, PS의 경우, 내부코팅층과 외부코팅층의 모양이 동일하고, 무공극층이 형성된 것으로 나타났다. 코팅방법에 따른 생물활성촉진물질의 용출율은 증류수조건에서보다 해수조건에서 다소 높았고, 질산염이 황산염에 배해 다소 빨리 용출되었으며, 정체조건에 비해 난류조건에서 약 50%이상 높았다.
Toluene을 유일 탄소원으로 배양한 혼합미생물 군으로부터 순수미생물을 분리배양한 후, 염기서열을 분석하여 Pseudomonas sp. TDB4 균주를 얻었다. 이 균주의 VOC 분해능을 평가하기 위해 toluene, benzene, p-xylene, styrene을 대상기질로 하여 회분식 생분해실험을 진행하였으며, 단일 기질인 경우 toluene, benzene, styrene, p-xylene의 순으로 분해능이 좋은 것으로 나타났다. 또한 VOCs 혼합물을 주입하였을 경우에는 모든 조합조건에서 styrene, toluene, benzene, pxylene의 순서로 쉽게 분해하였다. 이러한 결과로부터 VOC가 공존할 경우 toluene과 p-xylene은 다른 VOC의 분해를 촉진시키지만 styrene은 저해물질로 작용함을 알 수 있었다. 한편 연속식 계면활성제 미생물 반응기(Bioactive Foam Reactor, BFR)에 혼합미생물 배양액과 TDB4 배양액을 접종하고 장기 운전하면서 운전특성과 미생물 동적변화를 확인하였다. VOCs 혼합물질 유입농도가 250 ppm 이상에서는 처리효율이 급격히 저하되었는데, FISH 분석 결과에 따르면 동일한 시점에서 TDB4가 차지하는 비율이 전체 미생물의 20% 미만으로 감소하여 BFR의 처리효율과 미생물상은 매우 밀접한 관련이 있음을 알 수 있었다. 본 연구 결과 FISH 분석법을 계면활성제 미생물 반응기의 미생물 군집변화 해석에 유용하게 사용할 수 있음을 확인하였으며, 미생물 반응조를 장기간 운전할 때에는 안정적인 처리효율을 유지하기 위하여 주기적인 식종을 해주는 것이 적절하다고 판단된다.
곤충은 장내에 서식하고 있는 미생물과 상호작용을 통해 공생하는 것으로 알려져 있으며, 이러한 공생자는 공진화를 통하여 극한 환경에서도 서식을 가능하게 한다. 이러한 관점에서 토양 속에서 부엽토와 식물 잔재를 먹고 사는 장수풍뎅이 유충의 장내에 존재하는 공생자는 식물병원균을 방제하는 데 유용한 미생물이 존재할 것으로 생각된다. 따라서, 식물병원균에 대해 활성을 갖는 유용 미생물 10종을 장수풍뎅이 유충의 소화기관 전장, 중장, 후장으로부터 분리하였다. 분리된 10종의 유용 미생물은 유묘 검정을 통하여 토마토 잿빛곰팡이병, 배추 뿌리혹병, 고추 탄저병, 고추 역병에 대하여 강력한 항균 활성을 확인하였다. 10종의 항균활성 미생물은 형태적 특성과 16s rRNA gene 분석으로 Bacillus속 4종, Paenibacillus속 3종 및 Streptomyces속 3종으로 동정되었다. 유용 미생물은 인산 가용화, indole-3-acetic acid, siderophore 생성 활성이 우수하며 진균외막가수분해 효소인 β-1,3-glucanase, pretease 활성을 보였다. 10종의 유용 미생물 중, DM152 균주는 토마토와 고추 식물체의 모든 기관에서 생장을 촉진시켰다. 따라서, 장수풍뎅이 유충의 소화기관으로부터 분리된 10종의 장내 미생물은 생물학적 방제제 및 생물비료의 활용 가능성을 나타내었다.
본 연구는 식물성장촉진 근권세균인 Bacillus sp. SH1RP8를 친환경 생물비료로 이용하기 위하여 수행되었다. SH1RP8 균주를 동결건조시 세포의 용혈을 방지하도록 여러 가지 동결건조 보호제를 첨가하여 균주의 성장과 활성에 미치는 영향을 알아보았다. SH1RP8 균주의 동결건조 시 동결건조 보호제로 skim milk, glucose, peptone 등을 이용하였을 때, 그 중 5%의 skim milk를 첨가하였을 때 가장 높은 (30.6%)의 생존율을 보였다. 또한, 균주의 성장을 촉진하는 기질 그룹을 첨가하여 5%의 skim milk 단독으로 첨가한 경우와 기질 그룹을 각각 첨가한 경우의 동결건조 보호 효과를 비교하여 보았다. 그 결과 5% skim milk에 glycerol을 동시에 첨가할 경우 균주의 생존율이 skim milk 단독 첨가효과와 비교 시 214.29%의 향상율을 보여주었다. 또한 동결건조된 Bacillus sp. SH1RP8 은 매우 효과적인 PGPR로 활성을 보여주어 생물비료로서의 훌륭한 기능이 기대된다.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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