유용발효미생물에 의한 cordycepin 고함유 동충하초 분말의 생리활성 작용 및 물질을 개발하기 위한 기초 자료를 얻을 목적으로 2 종의 유산균 Lactobacillus hilgardii (Lh), Lactobacillus acidophilus (La)와 1 종의 효모 Saccharomyces cerevisiae (Sc), 1 종의 바실러스 Bacillus subtilis (Bs), 4 종의 곰팡이 Aspergillus oryzae (Ao), Aspergillus kawachii (Ak) 및 Monascus purpureus (Mp), Rhizopus oryzae (Ro)를 본 실험에 사용하였으며, 이들에 의한 발효 cordycepin 고함유 동충하초 분말의 미네랄 함량, 지방산 조성, 단백질 함량, 단백질 패턴, 항산화 활성, 혈전용해 활성을 비교 검토하였다. 발효 cordycepin 고함유 동충하초분말의 주요 미네랄은 미네랄 성분 조성은 K, Mg, Ca, Na, Fe, Zn로 나타났으며, 전체적으로 K, Mg, Ca 순으로 높은 비율을 차지하였고, 주요 지방산 성분으로 palmitic acid, stearic acid, oleic acid, linoleic acid, linolenic acid 이다. 동충하초 분말과 cordycepin 고함유 동충하초분말 및 발효시킨 cordycepin 고함유 동충하초 분말 단백질을 native-PAGE로 비교분석 한 결과 발효에 의해 균주에 상관없이 특정 부분의 단백질 분해를 확인하였고, SDS-PAGE 상의 단백질 패턴 분석에서는 66 kDa 크기의 단백질 밴드가 유산균 발효에 의해 분해 되어 거의 관찰되지 않았으며, Aspergillus oryzae에서 새로운 단백질 밴드를 확인하였다. Cordycepin 고함유 동충하초 분말을 유용미생물로 발효시킨 결과 Bacillus subtilis 균주 발효에서 혈전용해 활성이 17.1 unit으로 높게 나왔으며, Lactobacillus hilgardii 균주 발효에 의해서는 7.2 unit으로 낮은 혈전용해 활성이 나왔다. 항산화 활성은 발효시킨 cordycepin 고함유 동충하초 분말에서 균주 종류에 관계없이 거의 비슷하게 나왔지만 시판 항산화제 BHT 처리구의 90% 이상의 높은 항산화 활성보다는 낮았다. 이상의 실험결과에서 유용미생물 발효에 의한 cordycepin 고함유 동충하초 분말의 이화학적 특성이 발효 전 cordycepin 고함유 동충하초 분말보다 강화됨으로써 건강식품의 소재로서의 이용 가능성이 높다고 할 수 있다.
본 연구에서는 동충하초 추출물을 이용한 건강지향적인 리큐르를 개발하고, 제조방법에 대한 기준을 마련하였다. 동충하초 리큐르는 Sample을 21가지의 처리구로 나누어 제조하였고, 각각의 Cordycepin의 함량, Cordycepin의 안정성, 알코올 함량(Methanol and Ethanol)을 분석하였다. 시료 내 Cordycepin 함량분석 결과 증류 후에 동충하초를 넣고 3개월 침출한 시료의 경우(DL-3) 최대 $58{\mu}g/mL$ 검출되었고 발효 시에는 동충하초를 넣는 것은 무의미하므로 증류 후 동충하초를 넣어야 할 것으로 생각된다. 시료의 알코올 함량 분석 결과 Methanol은 시료 모두에서 검출되지 않았다. Ethanol 함량은 증류 후에 동충하초를 3개월 침출한 군에서 31.4%와 막걸리에 동충하초를 8 g 첨가한 군에서 17.2%로 나타내었다. Cordycepin의 안정성을 분석한 결과 Cordycepin 함량이 보관도중에 조금씩 감소하는 결과를 보여 제품 생산 시 함량을 조금 높여서 생산하여야 할 것으로 생각된다.
눈꽃동충하초(Paecilomyces japonica)를 이용한 새로운 약용민속주를 개발하기 위하여 먼저 알콜발효조건을 검토하였다. 1.0%의 눈꽃동충하초를 함유한 덧밥에 코지를 10%첨가하고 Saccharomyces cerevisiae를 이용하여 제조한 주모를 첨가한 후 $25^{\circ}C$에서 15일간 발효 시켰을 때 에탄올이 가장 많이 생성되었다. 눈꽃동충하초를 0.1%, 0.5%, 1.0%, 2.0%씩 각각 첨가하여 제조한 동충하초 민속주들의 관능검사와 생리기능성을 조사한 결과 눈꽃동충하초를 0.1% 첨가하여 제조한 D-1 눈꽃동충하초 민속주가 기호도가 제일 높았고 혈전용해활성과 아질산염 제거 작용이 각각 11.2U와 19.8%로 대조구인 동충하초를 첨가하지 않고 제조한 민속주보다 우수하였다.
곤충을 기주로 하여 자실체를 형성하는 곤충기생균(entomopathogenic fungi)의 일종인 풍뎅이동충하초(Cordyceps scarabaeicola Kobayasi)는 풍뎅이상과(Scarabaeoidea)의 성충을 기주로 하여 자실체를 형성한다(Evans, 1982; Evans and Samson 1982; Humber(unpublished); Kobayasi, 1940). 풍뎅이동충하초(C. scarabaeicola)는 자낭균아문(Ascomycotina), 핵균강(Pyrenomycetes)의 맥각균목(Clavicipitales), 동충하초과(Cordycipiteae), 동충하초속(Cordyceps)에 속하며 한국을 비롯하여 중국, 일본 등 전 세계적으로 분포한다(Dennis, 1981; Sung, et al, 1997; 청수. 1981). 또한 이(1996)는 풍뎅이동충하초의 불완전세대는 Beauveria속의 분생포자를 형성한다고 보고하였다. 풍뎅이동충하초는 MCM에서 잘 생장하나 균사밀도는 PDA배지가 가장 적합한 것으로 나타나 다른 버섯균과는 별다른 차이를 보이지 않았으며 온도는 $25^{\circ}C$가 가장 좋았으며 pH는 $7.5{\sim}9.0$으로 균주에 따라 차이를 보였다. 이러한 결과는 이(1996)의 연구결과인 PD배지와 $24^{\circ}C$에서 우수한 균사생장을 보였고 $30^{\circ}C$에서는 약간의 균사생장이 억제되었고, pH $8{\sim}9$의 알카리성 범위에서 우수한 균사생장을 보였다는 보고와 거의 일치함을 보였다. 풍뎅이동충하초는 탄소원을 첨가하지 않은 것에서 균사생장이 가장 높게 나타났지만 균사밀도는 가장 낮게 나타났다. 균사생장과 밀도는 lactose가 적합한 탄소원으로 나타났으며, 질소원은 ammonium phosphate에서 높은 균사생장을 보여 모두 무기태 질소원에서 우수함을 보였다.
본 연구는 갈색거저리 동충하초 열수 추출물을 첨가한 발효유의 물리화학적 특성과 항산화 효과에 대해 조사하였다. 갈색거저리 동충하초의 일반성분은 수분 10.85%, 조단백질 18.44%, 조지방 2.07%, 조회분 5.46%로 나타났으며 용매별 DPPH 자유 라디칼 소거 활성을 측정한 결과 물 추출물이 74.81 EDA%로 가장 높은 활성을 보였다. 갈색거저리 동충하초 열수 추출물 첨가 발효유의 발효시간에 따른 산도는 동충하초 추출물의 첨가량이 증가할수록 산도가 증가 하였다. pH는 발효 4시간째 4.60-4.66에 도달 하였고, 시료구별 유의적인 차이는 보이지 않았다. 유산균수는 동충하초 1% 첨가 발효유가 11.70 log CFU/mL으로 가장 높았고, 동충하초 0.5% 첨가 발효유가 10.63 log CFU/mL로 가장 낮았다. 동충하초 열수 추출물 첨가량에 따른 발효유의 수분함량은 유의적인 차이를 보이지 않았다. 조단백질의 함량과 조지방 및 조회분 함량 또한 갈색 거저리 첨가량에 따른 유의적인 차이를 보이지 않았다. 발효유의 무기성분 중 K가 3.02-4.35 mg%로 가장 높은 함량을 보였고, Na와 Ca가 2.31-3.10 mg%와 2.23-2.49 mg%로 검출 되었다. 발효유의 색도를 측정한 결과 L 값은 갈색거저리 동충하초 열수추출물의 농도가 증가 할수록 낮아졌고, a 값과 b 값은 갈색거저리 동충하초 추출물의 첨가량이 증가 할수록 값이 높아졌다. 발효유의 유리아미노산은 control군이 829.90 mg%인 것에 반해 갈색거저리 동충하초 추출물 0.5, 1, 3, 5, 8% 시료에서는 1,072.25-1,573.08 mg%로 추출물의 첨가량이 증가 할수록 높은 함량을 보였다. 발효유의 DPPH 자유라디칼 소거능을 측정한 결과 갈색거저리 동충하초 열수 추출물 8% 첨가 발효유가 58.05%로 가장 높게 나타났다. ABTS 자유라디칼 소거능은 동충하초 열수 추출물이 들어가지 않은 대조구에서는 42.60%로 가장 낮은 활성을 보였고, 동충하초 추출물의 첨가량이 증가 할수록 활성이 높아지는 농도에 따른 유의적 차이를 보였다. 갈색거저리 동충하초 열수 추출물을 첨가한 발효유의 관능평가 결과 종합적인 기호도는 1%, 3%, 0.5%, control, 5%, 8% 순으로 높았다. 갈색거저리 동충하초 열수 추출물을 첨가한 발효유의 저장기간에 따른 산도, pH 및 유산균수 변화를 측정한 결과 발효유는 저장기간 15일까지 액상 발효유 품질 규격의 산도, pH 및 유산균수의 기준치에 적합하였다.
기존의 황국균을 이용하여 제조하는 고추장의 품질을 개선 하고자 항암 및 강장에 효과가 있는 동충하초를 이용한 코오지로 제조한 고추장의 품질특성을 조사하였다. 동충하초를 이용하여 제조한 코오지가 황국균을 이용하여 제조한 코오지에 비해 효소역가의 경우 protease의 활성은 우수한 것으로 나타난 반면 amylase의 역가는 낮은 것으로 나타났다. 고추장을 제조하여 맛, 향, 색 및 전체적인 기호도에 있어 황국균을 이용하여 제조한 코오지와 동충하초를 이용하여 제조한 코오지를 7:3의 비율로 혼합하여 숙성한 것이 기존의 황국균만을 이용하여 제조한 고추장에 비해 우수한 것으로 나타나 동충하초를 이용할 경우 기존의 황국균으로 제조하는 고추장에 비해 품질을 개선할 수 있는 효과가 있는 것으로 나타났다.
약용식물의 발효는 새로운 식품의 소재 개발이 가능하나, 발효 균주는 대부분 이스트, 유산균, 박테리아 등이 이용되고 있다. 본 연구에서는 감초와 번데기 단독 또는 감초에 발효원인 번데기를 20%와 50%로 첨가한 혼합물의 배지에 눈꽃 동충하초(Paecilomyces tenuipes)와 밀리타리스 동충하초(Cordyceps militaris)를 이용하여 고체배양방법을 확립하였다. 동충하초 발효물을 식품소재로 개발하기 위하여 식용 가능한 용매인 에탄올 95%, 70%, 50%, 25% 및 물로서 추출한 다음 동충하초로부터 생성된 cordycepin과 감초의 지표성분인 liquiritin, liquiritigenin과 glycirrhizin의 함량 및 NO생성 억제효과를 조사하였다. Cordycepin함량은 감초에 번데기를 50%로 혼합한 배지에 밀리타리스 동충하초 균주을 접종하여 발효한 발효물을 70% EtOH추출하였을 경우에 가장 많았으며, 번데기를 첨가하지 않은 밀리타리스 동충하초 발효물 추출물보다 함량이 33배 정도 증가하였다. 또한 추출용매의 극성이 70% EtOH보다 높거나 낮아지면 감소하는 경향이었으며, 특히 발효원으로서 번데기의 첨가는 cordycepin의 함량을 현저하게 증가시켰다. Liquiritin의 함량은 발효하지 않은 감초보다 눈꽃 동충하초와 밀리타리스 동충하초로 발효한 모든 추출물에서 감소하였다. Liquiritigenin의 함량은 눈꽃 동충하초로 발효한 추출물이 밀리타리스 동충하초 발효 추출물보다 현저히 증가하였으나, 밀리타리스 동충하초 균쥬의 발효 추출물은 발효하지 않은 감초 추출물과 거의 차이가 없었으며, 두 균주 모두 번데기의 첨가량이 증가할수록 liquiritigenin의 함량이 감소하는 경향이었다. 감초에 번데기의 첨가량 또는 추출 용매의 극성이 증가하면 liquiritin과 glycyrrhizin의 함량은 현저히 감소하였다. 이상의 결과로부터, cordycepin 함량은 C. militaris 균주로 liquiritigenin은 P. tenuipes로 발효시에 현저하게 증가하였으나, liquiritin과 glycyrrhizin은 감소하였다. 감초를 동충하초로 발효시에 번데기의 첨가는 주요 성분의 변화를 현저하게 유도하였다. 동충하초 발효 추출물은 NO생성 억제효과가 증가하였으며, 고극성 용매 추출물에서 그 효과가 현저하였다. 감초의 발효시에 생성된 cordycepin과 liquiritin, liquiritigenin 및 glycyrrhizin의 함량은 발효원으로서 첨가되는 번데기, 추출용매의 극성, 발효 균주의 종류 등에 따라서 현저한 차이가 있었다. 이러한 결과는 동충하초 균주를 이용한 기능성 식품 소재를 개발하기 위한 기초 자료로서 활용이 가능할 것으로 기대된다.
동충하초(눈꽃 동충하초, 번데기 동충하초), 쑥 및 솔잎 추출물의 항균작용을 조사하기 위하여 동충하초의 자실체와 균사체, 쑥 및 솔잎을 물과 70% 에탄올로 추출하였다. 항균실험에는 3종류의 그람양성균(Bacillus subtilis, Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus)과 3종류의 그람음성(Escherichia coli, Shigella sonnei, Salmonella typhimurium) 식중독 및 병원성 세균을 사용하였다. 동충하초의 추출수율은 물과 에탄올 모두 자실체의 수율(39∼58%)이 균사체(9∼24%)에 비하여 2.4∼4.4배 높았으며, 쑥과 솔잎 추출물의 수율은 9%미만이었다. 눈꽃 동충하초의 에탄올추출물(JME)은 1%농도에서 L. monowtogenes에 대하여 항균활성을 나타내었으며 번데기 동충하초의 에탄올추출물(MFE)은 3%농도에서 S. aureus에 대하여 항균활성을 나타내었다. 쑥의 에탄올추출물(MGE)은 1% 농도에서 L. monocygenes와 S. aureus에 대하여 항균활성을 나타내었으나 눈꽃 동충하초, 번데기 동충하초 및 쑥의 물추출물은 시험균주에 대하여 항균활성을 나타내지 않았다. 솔잎 물추출물은 E. coli를 제외한 모든 균주에 대하여, 솔잎 에탄올추출물은 실험에 사용한 모든 균주에 대하여 항균활성을 나타내어 솔잎추출물들은 가장 폭넓은 항균스펙트럼을 나타내었다. 액체배지내에서 솔잎추출물의 세균증식 억제작용은 에탄올추출물이 물추출물에 비하여 큰 편이었다.
동충하초는 곤충의 몸속에 들어가 버섯이 발생하는 곤충 기생성 약용 버섯으로 세계적으로 인체에 유용한 활성물질이 확인되었으며, 이를 누에를 이용하여 인공재배할 수 있는 기술이 개발되어 활용되고 있다. 그러나 누에품종에 따른 동충하초의 생산성에 대한 연구 보고는 없는 실정이다. 본 연구에서는 장려품종 3품종(백옥잠, 금옥잠, 대성잠)과 특수품종 2품종(연록잠, 골든실크)을 이용하여 눈꽃동충하초의 재배조건과 특징을 조사하였다. 눈꽃동충하초 균주(P. tenuipes)에 대한 감염율은 금옥잠이 가장 높았으며, 백옥잠, 대성잠, 골든실크, 연록잠 순으로 감염율이 높았다. 눈꽃동충하초를 재배하기 위한 최적조건은 어두운 장소에서 번데기 당 약 $4cm^2$의 재배밀도로 $22^{\circ}C{\pm}1$를 유지해 주는 것이었다. 또한 우리는 농가소득 향상을 위해, 동충하초의 수요가 있을 때 마다 수시로 재배할 수 있는 연중재배 기술을 개발하였다. 연중재배 방법은 먼저 동충하초균에 감염된 번데기 체내의 수분함량을 자연건조로 3% 이하로 낮추고, 이를 진공포장 후 $4^{\circ}C$ 이하에서 보관하는 3단계의 과정이 필수적이다. 이렇게 저온에 보관되어 있는 감염번데기는 언제든지 물에 침지하여 번데기 내의 함수율을 원래대로 복원 시킨 다음 최적 재배조건에서 재배하여 동충하초를 생산할 수 있게 함으로 연중생산이 가능하다. 그러므로 우리는 동충하초 재배농가가 누에 품종 중 금옥잠을 이용하고 연중생산 기술을 활용하여 소득증대를 이룰 수 있을 것으로 기대한다.
본시험은 한국에서 채집되어 강원대학교 동충하초은행(EFCC)에서 보관 중인 눈꽃동충하초의 분포와 배양적 특성을 조사하였다. 눈꽃동충하초는 한국의 산이나 계곡에서 어렵지 않게 채집할 수 있으며 골고루 분포한다. 채집시기는 7~9월로 나타났으며 9월말에 가장 많이 채집할 수 있으며 채집된 눈꽃동충하초의 종은 눈꽃동충하초(P. tenuipes)가 가장 높게 채집되었다. 눈꽃동충하초의 균사배양 최적배지는 PDA배지이며 SDAY와 HMA배지에서도 생장은 가능하며 균사생장에 가장 적합한 온도는 $25^{\circ}C$이며 pH는 6.0~7.0으로 나타났다. 적합한 영양원으로는 탄소원은 dextrose이었으며, 질소원은 tryptone가 가장 우수하였고, 무기염으로는 $KH_2PO_4$에서 가장 고른 성장을 보였다. C/N에서는 20 : 1의 비율이 가장 적합한 것으로 조사되었다.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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