• 분석과학
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• 제28권5호
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• pp.331-340
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• 2015

DNA/RNA결합 단백질로 다양한 기능을 한다고 알려진Fused in Sarcoma (FUS)의 유전자 돌연변이가 루게릭병 및 전측두엽성 치매 환자에서 발견되었다. 정상적인 FUS는 핵에 위치하지만 병리상황에서 FUS는 세포질로 잘못 타기팅 되어 스트레스 응집체와 결합된 단백질 응집체를 형성하는 것으로 알려졌다. 그러나 이들에 의한 스트레스 응집체 형성 기전 및 응집체 형성에 관여하는 FUS의 도메인은 정확히 알려지지 않았다. 따라서, 본 연구에서는 루게릭병 연관 FUS 미스센스 돌연변이(P525L, R521C, R521H, R521G)의 세포내 위치 및 세포질 FUS의 응집체 형성에 관여하는 FUS내 도메인을 분석하고 동정하고자 하였다. 이를 위해 먼저, FUS 미스센스 돌연변이의 세포내 위치를 분석한 결과, P525L대부분은 세포질로 위치하여 스트레스 응집체를 형성하는 반면, R521C, R521H, R521G는 핵과 세포질에 위치하였다. 이를 통해 FUS의 핵으로의 이동에는 FUS의 마지막 2개의 아미노산이 매우 중요함을 확인할 수 있었다. 세포질로 빠져 나온 FUS의 응집체 형성에 관여하는 FUS도메인 분석을 위해서 핵 위치서열이 결손되어 대부분 세포질 응집체를 형성하는 FUS-∆17를 이용하여, 다양한 도메인 결손 돌연변이를 제작하고, 이들의 응집체 형성여부를 분석하였다. 그 결과, SYGQ-RGG1나 RGG2-ZnF-RGG3없는 세포질 FUS (FUS-∆SYGQ-RGG1-∆17, FUS-∆RGG2-ZnF-RGG3-∆17)는 스트레스 응집체를 형성하지 않은 반면, RRM이 없는 FUS-∆RRM-∆17은 FUS-∆17에 비해 많은 스트레스 응집체를 형성함을 알 수 있었다. 따라서, 도메인 분석결과 세포질의 FUS는 SYGQ-RGG1나 RGG2-ZnF-RGG3 도메인을 통해 FUS 스트레스 응집체 형성이 촉진되고, RRM도메인은 FUS 응집체 형성을 저해하고 있는 것으로 생각된다. 이러한 연구 결과는 FUS의 스트레스 응집체 형성과 연관된 다양한 퇴행성 뇌질환의 발병기전에 대한 이해뿐만이 아니라 이들 질환 치료를 위한 치료 후보 타겟 물질 발굴에 중요한 단서를 제공할 수 있을 것이다.

• Clinical and Experimental Reproductive Medicine
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• 제31권2호
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• pp.119-131
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• 2004

연구 목적: 난소에서 분비되는 스테로이드 호르몬인 에스트로젠과 프로게스테론은 포유동물의 생식기관 발달과 정상적인 생식 기능, 수정과 배아의 착상에 중요한 역할을 한다. 특히 에스트로젠은 자궁내액을 내강으로 분비하여 자궁부종 기작에 중요한 역할을 한다. 자궁내액은 정자의 수정능력 획득과 착상전 배아의 발달에 매우 중요하다. Aquaporin (AQP)은 막관통 물수송 단백질로서 여러 조직에 넓게 분포되어 있으며, 세포간 또는 상피세포간 물의 이동에 중요한 역할을 한다. 본 연구에서는 생쥐 자궁에서 스테로이드 호르몬에 의해 조절되는 자궁내액의 이동에 AQP 유전자가 관여하는지를 알아보았다. 연구 재료 및 방법: 난소 절제술을 시행한 생쥐에 스테로이드 호르몬을 피하주사하고 6, 12, 24시간 간격으로 자궁조직을 적출하였다. 대조군은 sesame oil만을 주사한 후 6시간째에 수획한 자궁조직을 사용하였으며, 실험군은 시간대별과 스테로이드 처리별로 채취한 자궁조직에서 역전사중합효소반응을 수행하였다. 역전사중합효소반응을 통해 막관통 단백질인 AQP-4, -5, -8 mRNA의 발현양상을 살펴보았다. 또한 mRNA의 위치를 살펴보기 위해 laser microdissection을 이용하여 RT-PCR을 수행하였다. 마지막으로 자궁조직내에서의 단백질 발현 부위를 관찰하기 위해 면역조직화학염색을 실시하였다. 결 과: AQP-4, -5, -8 mRNA은 프로게스테론을 처리한 군보다 에스트로젠을 처리한 군에서 많이 발현되었으며, 에스트로젠을 주사한 지 6시간째 발현정도를 대조군과 비교할 때 AQP-4, -5, -8 mRNA가 각각 7.9배, 2.8배, 3.8배로 나타났다. AQP-4, -5, -8 mRNA는 간충조직보다 자궁내 상피조직에서 스테로이드 호르몬의 영향을 받아 발현양상의 차이가 나타났으며, 주로 에스트로젠의 영향을 받아 발현이 증가하였다. AQP-4 단백질은 에스트로젠을 24시간 처리한 후 프로게스테론을 처리한 군의 자궁내 상피조직에서 많이 발현되었으며, AQP-5와 -8 단백질은 에스트로젠을 처리한 군의 자궁내 상피조직에서 발현이 증가하였다. 결 론: 이상의 결과를 통해 AQP-4, -5, -8은 주로 에스트로젠에 의해 자궁내 상피세포에서 발현이 증가되는 것으로 보아 에스트로젠의 영향하에 일어나는 자궁내액의 이동으로 인한 자궁부종기작에 이동통로로서 관여하는 것으로 사료된다.

• 생명과학회지
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• 제22권1호
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• pp.16-24
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• 2012

Polyamine은 모든 세포의 성장과 분화에 필수적인 요소지만 그 기작은 아직 정확하게 밝혀져 있지 않다. 본 논문에서는 MCF-7세포에서 spm의 세포독성 기작을 연구하였다. MTT assay 결과 저농도의 spm (<10 ${\mu}M$) 처리시 cell viability가 증가하는 반면 고농도의 spm 처리시 처리 시간과 처리 농도에 의존적으로 감소되었으며, 이는 고농도의 spm이 MCF-7 cell에 cytotoxic한 효과를 가지고 있는 것으로 사료된다. Cell cycle 분석 결과 spm 농도에 의존적으로 sub-G1 단계의 세포 양이 증가하는 것으로 나타났으며, 이는 spm이 세포분열을 억제함으로써 세포사를 유발하는 것으로 생각된다. 또한 고농도의 spm 처리 후 2시간이 지나자 cell 표면이 움츠려 들며 rounding되기 시작하여 하루가 지난 후 거의 모든 cell이 culture dish 에서 떨어진 것을 관찰할 수 있었다. 이는 spm이 세포부착에 관여하여 세포사를 유발하는 것이라 생각되며, 세포부착을 조절하는 Integrin ${\beta}1$은 저농도의 spm에선 별다른 차이를 보이지 않다가 농도가 높아질수록 조금씩 감소하였으며, cytoskeletal protein인 actin은 농도의존적으로 감소하였다. 반면 adhesion protein인 FAK는 저농도의 spm 처리시에도 급격히 감소하였다. 이는 spm이 adhesion 및 cytoskeletal proteins의 발현을 억제하는 것으로 보이며, 특히 Integrin ${\beta}1$과 actin에 비해 FAK에 더 많은 영향을 끼치는 것으로 사료된다. 단백질들의 세포막상의 분포에 관한 연구에서, membrane 상에 위치하던 Integrin ${\beta}1$은 10 ${\mu}M$의 spm 처리시 세포 내로 약간의 위치변동이 일어났으나 그 양에는 크게 차이가 없었으며, 반면에 actin은 위치상엔 큰 변화가 일어나지는 않았지만 농도에 따라 크게 감소하는 것으로 나타났다. 세포이동과 형태조절에서 중추적인 역할을 하는 FAK는 세포막 안쪽에 위치하고 있다가 spm 처리시 세포 가운데로 이동하는 모습이 관찰되었으며 그 양도 크게 감소하였다. 이상의 실험에서 세포 내 spm의 변화는 MCF-7 cell의 adhesion protein인 Integrin ${\beta}1$과 FAK, 그리고 cytoskeletal protein인 actin의 발현을 조절하여 cell attachment를 억제함으로써 세포분열과 생장을 억제하는 것으로 분석된다.

• 한국발생생물학회:학술대회논문집
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• 한국발생생물학회 2001년도 후기 제12차 학술대회 논문집
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• pp.36-37
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• 2001

큰가리비는 자웅이체이다. 난환형성과정은 난모세포의 발달정도에 다라 다르게 나타나고 있다. 난자형성과정은 난원세포기, 전난황형성난모세포기, 초기난황형성난모세포기, 후기난황형성난모세포기, 성숙난모세포기의 연속적인 5단계의 과정으로 나눌 수 있었다. 전난황형성기 난모세포질 내에서는 핵주변 구역에 골지장치와 수많은 공포들 및 미토콘드리아들이 출현하고 있는데 이들은 차후, 지방적 형성에 관여한다. 난황형성전기난모세포(previtellogenic oocyte)에서는 지방적 및 지질과립들이 핵막 근처에서 출현하여 피질층쪽으로 분산되는 반면, 같은 발달 단계의 난모세포질의 피질구역에서는 피질과립들(단백질성 난황과립)이 처음으로 생성되어 난황막 근처의 피질층에서 핵주변 구역쪽으로 분산.분포된다. 난황형성후기 난모세포에서는 세포질 내의 골지장치, 공포, 미토콘드리아, 그리고 조면소포체들이 자율합성에 의해 난황과립 형성에 관여하고 있다. 반면 외인성 물질들인 지질형태의 과립들, 다량의 글리코겐 입자들이 생식상피 내에서 출현하고 있는데. 이들 물질이 생식상피에서 난황막 구조물인 미세융모를 통해 난황형성 후기 난모세포의 날질 내로 통과해 들어가는 현상이 관찰되었다. 이와같은 현상은 난황형성이 일어날 때에 heterosynthesis가 일어나고 있음을 시사한다. 완숙난모세포의 난경은 약 50~60$\mu\textrm{m}$이다. 정자형성과정은 정원세포기, 제1차정모세포기, 제2차정모세포기, 정세포기, 정자기의 연속적인 5단계로 나눌수 있었다. 정셍포기에서 정자로 변태되는 과정 중에 침체의 분화과정이 있는데 이에는 1. Golgi phase, 2. Cap phase 3. acrosome phase, 4. maturation phase의 단계를 거쳐 첨체가 완성된다. 정자는 원시적 형태를 이루고 있으며 4개의 미토콘드리아가 부핵을 형성하고 있다. 완숙정자 두부의 길이는 대략 $3 \mu$m 이며, 미부의 길이는 약 $30 \mu$m정도이다. 정자 미부편모의 axoneme은 중앙의 2개의 미세소관(microtubule)과 주변에 위치한 9개의 2중 미세소구관(microtublue)으로 이루어져 있다.

• 한국산학기술학회논문지
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• 제12권7호
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• pp.3096-3102
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• 2011

바닐로이드 수용체 TRPV1(transient receptor potential vanilloid 1)은 캡사이신, pH, 열 등의 통증 유발물질에 의해 활성화되는 비특이적 양이온 채널로서 통증발현에 핵심적인 막 단백질이다. TRPV1의 막 수송에 관한 연구가 미미한 가운데 FIP3(family of Rab11 interacting protein 3)가 TRPV1 채널과 결합하여 막수송에 관여한다고 보고되었다. FIP3는 Rab11과 결합하는 단백질인데 최근 Rab11 단백질이 여러 채널 단백질의 막수송에 직접적으로 또는 간접적으로 중요하다고 보고되었다. 그러므로 본 연구에서는 Rab11이 TRPV1의 막 수송에서의 역할을 알아보기 위하여 세포 생물학적, 생화학적으로 알아보았다. 공촛점 현미경을 통하여 확인한 결과 Rab11은 실제로 세포내에서 TRPV1과 동일한 위치에서 발현되어 있음을 확인하였다. 하지만 생화학적인 방법인 GST-pulldown을 실시하였을 때 TRPV1과 Rab11간에는 서로 직접적인 결합은 하지 않는 것으로 나타났다. 비록 직접적인 결합은 하지 않지만 Rab11이 TRPV1의 막 수송에 관여한다고 가정하고 Rab11의 TRPV1의 막수송에서의 역할을 더 자세히 알아보기 위하여 세포내 Rab11a의 발현을 siRNA를 사용하여 Rab11a의 발현을 50%수준으로 저해한 후 TRPV1의 세포막으로의 이동을 알아본 결과 Rab11 발현 저해 시 세포막에 이동된 TRPV1이 현저히 감소함을 확인할 수 있었다. 이 결과로부터 Rab11이 아마도 FIP3을 포함하는 방법으로 TRPV1의 막 수송에 영향을 주는 것으로 결론지을 수 있다.

• 미생물학회지
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• 제47권1호
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• pp.7-13
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• 2011

일반적으로 대장균을 숙주로 이용하여 고등생물 유래 막단백질을 발현시킬 경우 발현된 막단백질은 숙주 세포에 치명적인 독성을 보인다. 우리가 발현을 시도한 15개의 인간 막단백질 중에서 특히 퓨린수용체 $P2X_4$ 발현은 대장균에 강한 독성을 보였다. 이러한 독성의 원인을 알아보기 위해 hydroxylamine을 사용하여 하여 인간 $P2X_4$ 유전자를 돌연변이 시키고 독성이 약해진 돌연변이체를 선별하였다. 돌연변이체 단백질을 면역블랏으로 분석한 결과 야생형에 비해 모두 단백질의 크기가 작았다. 크기가 제법 큰 돌연변이 두 개를 골라 DNA 서열분석을 해보니 130번째, 또는 194번째 Trp 코돈이 종결코돈으로 바뀜으로써 두 번째 막통과 도메인이 사라진 truncated protein이라는 사실을 알았다. 이들 돌연변이체의 세포내 위치를 추적해보니 둘 다 세포막에 삽입되어 있지는 않았다. 이런 결과를 종합해 볼 때 $P2X_4$의 발현이 대장균에 독성을 보이기 위해서는 전체 단백질의 올바른 세포막 삽입이 중요함을 시사한다.

• 한국미생물·생명공학회지
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• 제17권5호
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• pp.499-503
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• 1989

Cryptosporidium이 인체 내에서 복잡한 life cycle를 거치면서 각 stage마다 만들어지는 단백질 항원의 관계성에 관한 보고가 없어 Cryptosporldiosis에 대한 치료제 개발에 어려움이 있었다. 본 연구는 단일군 항체와 Immunogold labeling 기술을 이용하여 주요 extracellular stages인 sporozoites와 merozoites의 antigenic relatedness를 살펴보았다. BALB/C 쥐로부터 merozoites에 대한 단일군 항체(Jo3)를 분리하였으며 IgG3형이었다. 정제된 sporozoites를 SDS-PAGE로 분리한 후 Western blot을 이용하여 Jo3를 반응시킨 결과 3,500Daltons 크기의 sporozoites 항원을 인식하였다. Jo3를 Cryptosporidium에 감염된 tissue section에 반응시킨 후 Immunoelectron microscopy를 이용하여 3.5-kDa 항원의 위치와 sporozoites와 merozoites가 똑같은 단백질 항원을 만드는가를 추적해 본 결과 3.5-kDa 단백질 항원이 두 stages에서 공동으로 합성되는 것으로 나타났으며 이 항원은 표면과 세포질 내에 위치하고 있었다.

• 한국식품과학회지
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• 제19권5호
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• pp.441-445
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• 1987

발아중인 대두콩에서의 lipoxygenase의 세포내 위치를 차별 원심 분리법과 밀도 구배법을 이용하여 규명하였다. 차별 원심 분리법을 사용하였을때, lipoxygenase활성은 거의 supernatant fraction에서 나타났으며, 1.5%의 활성만이 particulate fractions에서 나타났다. 밀도 구배법에서는 lipoxygenase와 acid phosphatase의 활성이 1.19, 1.23, $1.25g/cm^3$의 높은 밀도들에서 일치하였으며, 이것은 발아중 가수분해되는 단백질체내에 이 효소가 국재되어지는 것으로 사료되어진다. 다른 세포내 소기관인미토콘드리아, ER, 그리고 glyoxysomes에 lipoxygenase가 존재한다는 증거는 보이지 않았다.

• 생명과학회지
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• 제24권8호
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• pp.820-826
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• 2014

세포표면 수용체와 통로가 적절히 기능하려면 특정 세포 내 위치로 배치되고 조절되어야 한다. PSD95/Dlg/Zo-1 (PDZ) 도메인은 이러한 배치와 조절을 매개하는 다양한 단백질들을 인식하고 이 단백질들이 서로 결합하는데 관여한다. MUPP1은 13개의 PDZ domain을 가지는 단백질로서 여러 구조 단백질 및 신호전달 단백질과 상호 결합하지만, MUPP1이 어떻게 안정화되며, 어떻게 신호전달과정에 관여하는지에 대해 아직 명확히 밝혀지지 않았다. 본 연구에서 MUPP1의 PDZ 도메인과 상호 작용하는 단백질을 규명하기 위하여 효모 two-hybrid 방법을 이용하였고, Parkin이 MUPP1과 결합하는 것을 확인하였다. Parkin은 E3 ubiquitin ligase로서, Parkin 유전자의 기능상실 돌연변이는 autosomal recessive juvenile parkinsonism을 일으키는 것으로 알려져 있다. Parkin은 MUPP1의 12번째 PDZ domain과 결합하지만, 다른 PDZ 도메인과는 결합하지 않았다. Parkin의 C-말단부위는 II 형 PDZ-결합모티프를 가지고 있는데, 이 모티프가 MUPP1과의 결합에 필수적임을 확인하였다. HEK-293T 세포에 MUPP1과 Parkin을 동시에 발현하여 발현위치를 확인한 결과 세포내의 같은 위치에서 발현하였다. 또한 Parkin은 MUPP1을 강하게 유비퀴틴화 하였다. 이러한 결과들은 MUPP1이 Parkin의 기질이며, Parkin에 의한 유비퀴틴화에 의해 MUPP1의 기능 혹은 안정성이 조절될 수 있음을 시사한다.

• 생명과학회지
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• 제27권10호
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• pp.1191-1198
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• 2017

세포 내 소기관들과 소포들은 세포 내에서 미세소관을 따라 적절한 구획으로 수송된다. 이러한 세포 내 수송과정은 분자 모터단백질인 kinesin과 dynein에 의하여 이루어진다. Kinesin 1은 오징어 축삭돌기 세포질로부터 처음 분리되었으며 2개의 중쇄단위체(KHCs, 또는 KIF5s) 및 이와 결합하는 경쇄단위체(KLCs)의 복합체를 형성한다. KIF5s는C-말단 고리 영역을 통해 많은 다양한 단백질과 결합하는데, 아직 그 결합단백질들은 충분히 밝혀지지 않았다. 본 연구에서는 KIF5A 결합단백질을 분리하기 위하여 효모 two-hybrid 탐색을 수행하여 스트레스 과립형성과 mRNP 위치결정에 관여하는 Ras-GTPase-activating protein (GAP) Src homology3 (SH3)-domain-binding protein 2 (G3BP2)를 분리하였다. G3BP2는 KIF5A의 C-말단 고리 영역에 존재하는 73개 아미노산을 포함하는 영역과 결합하였다. 그러나 G3BP2는 KIF5B, KIF5C, KLC1, KIF3A와는 결합하지 않았다. KIF5A는 G3BP2의 arginine-glycine-glycine(RGG)/Gly-rich 도메인과 결합하지만 G3BP1과는 결합하지 않았다. HEK-293T세포에 G3BP2와 KIF5A를 발현하여 면역침강한 결과 G3BP2와 KIF5A는 같이 침강하였다. 또한 HEK-293T 세포 내의 전체에서 두 단백질은 같은 부위에 존재하였다. 이러한 결과들은 세포 내에서 G3BP2는 KIF5A와 결합하는 결합단백질로 확인 되었다.