녹장균(Metarhizium ansiopliae)을 생물살충제로서 활용할 목적으로 녹강균의 균사생육 및 포자형성에 미치는 환경요인과 균사외 분비 효소 활성에 대하여 조사였다. M. anisopliae DGUM35001의 균사 생장을 보여주었으며, 공중균사는 SDPY 사용시 가장 우수하엿다. 최소배지로 Czapek-Dox 한천배지를 사용하여 탄소원 이용성 실험의 결과, 단당류에서 glucoserk 이당류에서 sucrose가 가장 우수한 탄소원이었다. 고분자 물질로 chitin 사용시 우수한 균사 생육을 보여주었다. 유기질소원으로 bacto-peptone과 soytone아 무기질소원으로 urea와 ammonium phosphate가 우수한 균사생육을 나타내었으며, 아미노산으로 serine 첨가시 가장 우수한 균사 생육을 나타내었다. Starch배지를 사용하였을 때 가장 우수한 포자형성의 결과를 얻었다. 액체배양후 군사를 제거한 상등액을 조효소액으로 사용시 analyase와 prorease 효소 활성이 우수하였다. 그러나,;ipase와 chitinase 효소활동은 상대적으로 낮았다.
전처리 후 얻어진 셀룰로스 고분자를 단당류로 전환하기 위해서는 셀룰라제를 이용한 당화 과정이 필요하다. 통상 실험식 연구에서는 셀룰로스 당화시 당수율을 최대로 하기위해 pH조절을 위한 Citrate buffer와 미생물 오염을 막기 위한 Autoclave에서의 멸균 과정을 거친다. 하지만 대량생산을 목적으로 하는 산업체에서는 적용이 어렵다는 문제점이 있다. 따라서 본 연구에서 이를 대신하여 산업체에서 적용 가능한 당화전환 공정의 효율성을 평가하고자 하였다. Autoclave 멸균을 대체하는 공정으로 항생제 첨가와 여과에 의한 제균을 선택하였고, citrate buffer를 대신하여 buffer를 첨가하지 않은 물을 pH를 조정하여 사용 하였다.실험결과 기존의 당화공정을 사용하였을 때 당화율이 81%이었고, pH를 조절한 제균 water에 항생제를 첨가하는 공정은 71%로 나머지 배지들 중 가장 높은 당화율을 나타냈다. 이것은 기존의 당화율보다 10% 낮은 수치이나 공정비를 교려하여 봤을 때 효율성 있는 공정으로 판단된다.
느타리버섯은 우리나라 국민에 기호성이 매우 높으며, 가장 많이 생산 소비되는 대표적인 버섯이다. 소비적 측면에서의 영양학적 가치 증진과 생리대사적인 측면에서의 흡수기작에 대한 특성을 확인하기위하여 배지내 당첨가에 따른 자실체의 당성분 변화를 조사하였다. 느타리버섯 톱밥 배지에 4종의 당을 첨가한 배지에 수한1호, 여름느타리, 춘추2호를 재배하여 자실체를 분석한 결과 단당류로는 Fructose, Glucose, Ribose, Xylose, 이당류는 ${\alpha}$-Lactose, Trehalose, 당알콜류는 Glycerol, Mannitol, myo-Inositol, Sorbitol의 성분이 검출 되었다. 모든 처리에서 발견되는 성분으로는 Trehalose, Mannitol, ${\alpha}$-Lactose, Fructose, Glucose, Ribose, myo-Inositol 등이며, 나머지 성분은 일부 처리에서만 발견되고, 많은 함량의 순서는 품종에 따라 약간 차이가 있었다. 자실체 내의 단당류는 함량 자체가 낮고, 공시품종 중에서 수한1호가 다른 품종에 비하여 약간 높았다. 처리된 당종류 및 처리함량의 증가에 따라 자실체의 성분함량이 뚜렷이 증감되는 경향은 확인되지 않았다. 배지에 처리된 성분중 Lactose는 처리량의 증가에 따라 모든 품종에서 뚜렷이 증가하였으며, 자실체의 Trehalose 함량은 품종에 따라 차이를 나타내었으나, 배지의 첨가량에 따른 영향은 보이지 않았다. 자실체 내의 당알코홀류는 수한과 춘추2호에서는 높은 편이나 여름느타리버섯에서는 낮아 품종간 차이가 있었다. 자실체의 Mannitol 함량은 배지의 당첨가량에 따른 일정한 경향은 없었으며, myo-Inositol은 수한과 춘추2호에서 처리량에 따라 서서히 증가하는 경향을 보였으나 여름느타리에서는 일정한 경향을 확인 할 수 없었다. 배지에 처리한 당류중에 처리량 증가에 따라 자실체의 함량이 품종에 관계없이 증가하는 것은 ${\alpha}$-Lactose 뿐이었으며, 자실체에서 발견되는 성분들은 배지성분의 흡수보다는 자실체 내의 대사기작 내에서 합성 또는 전환되는 것으로 추정되며, 앞으로 더 관련 연구가 필요할 것으로 사료된다.
단옥수수와 초당옥수수의 출사후 이삭의 성숙정도와 당함량, 이삭부위별 당도, 저장기간에 따른 당류의 변화등을 구명하기 위하여 작물시험장 전작시험포장에서 GCB 70과 NES를 1991년 3월 5일에 비닐하우스에서 파종육묘하여 4월 1일에 본포에 이식후 소형 비닐턴넬로 재배하였다. 출사후 15일부터 30일까지 5일 간격으로 4회 수확하여 생육특성 및 당함량을 조사하였으며 이삭의 부위별 당함양은 출사후 25일에 1회 조사하였다. 저장중의 당류조사 는 냉장고(4$^{\circ}C$)에 9일간 저장하였다가 2일간격으로 5회에 걸쳐 HPLC를 이용하여 총당함량중의 당류 변화를 분석한 결과를 요약하면 다음과 같다. 1. GCB 70과 NES 두 품종 모두 간장, 이삭무게, 100입중 등은 출사후 30일 까지 증가경향이었으나 출사후 25일과 30일 사이에는 증가폭이 좁았다. 2. 두품종 모두 출사후 15일에 당함량이 가장 높았으며 이삭의 발육정도는 출사후 30일가지 증가 경향이나 25일부터 당함량이 급격히 저하되므로 단 옥수수는 출사후 15~20일경, 초당옥수수는 출사후 20~25일경이 수확적기로 보였다. 3. 이삭부위별 당함량은 두 품종 모두 이삭하단>이삭중간>이삭상단 순위로 높았다. 4. 초당옥수수는 수확당시의 저장후 9일까지의 당도변화가 거의 없었으나 단옥수수는 저장 3일후 부터는 당도가 급격히 저하되었다. 5. 총당중에서 Sucrose, Glucose, Fructose 등은 단옥수수보다 초당옥수수보다 단옥수수가 높았다.
군소에서 추출한 다당류로부터 DEAE-Sepharose 상에서 glycosaminoglycan(GAG)을 정제하여 기능기의 분포, 구성당의 분포, 이당류의 조성과 당 구조를 조사하였다. 정제한 GAG는 기본 형태를 구성하는 이당류 단위가 전체 구성물 중 55% 이상을 차지하고 있는 다당 복합체였다. 정제한 GAG는 1648 $cm^{-1}$에서 amide I의 특징적인 띠와 1457 $cm^{-1}$에서 C-O stretch, 탄수화물 및 아미노산의 특징, 866 $cm^{-1}$에서 단당류의 특징을 보이는 것으로 나타났다. 정제한 GAG는 fucose, N-acetylgalactosamine, N-acetylglucosamine, glucose, galactose, 미량의 mannose와 xylose로 구성되어 있는 것으로 나타났고, 이중에서 N-acetylgalactosamine, N-acetylglucosamine이 70% 이상을 차지하는 다당 복합체인 heparan sulfate인 것으로 추정되었다. 군소 GAG는 단백질핵의 threonine 잔기에 O-연결된 GlyUA(2S)-GlcNS와 GlyUA-GlcNS(6S) 구조를 가지고 있는 것으로 나타났다.
바이오에탄올 생산을 위한 대체 바이오매스 자원으로 갈조류인 다시마의 활용 가능성을 평가하기 위하여 산 가수분해와 에탄올 발효 특성을 검토하였다. 산 가수분해는 발효 가능한 당류의 생산량을 증가시켜 에탄올 생산량을 크게 증가시켰다. 최대 환원당 생산량은 묽은 황산(1.0 N)을 이용하여 $130^{\circ}C$에서 6시간 가수분해하는 조건에서 다시마 건조무게 기준 135 mg/g이었다. Saccharomyces cerevisiae(ATCC 24858)는 글루코오스, 갈락토오스 및 만노오스와 같은 $C_6$-당을 에탄올로 발효시킬 수 있지만 아라비노오스나 자일로오스와 같은 $C_5$-당은 에탄올 발효기질로 이용하지 못하였다. 최적 발효시간은 글루코오스 48시간, 갈락토오스 72시간, 만노오스 96시간으로 단당류에 따라 달랐다. 그럼에도 불구하고 S. cerevisiae를 이용하여 $35^{\circ}C$에서 96시간 발효를 통해 가수분해물로부터 얻을 수 있는 에탄올 생산량은 가수분해물 중의 총환원당으로부터 얻을 수 있는 이론적 생산량에 비해 4배 정도 높은 다시마 건조무게 기준 242 mg/g에 달하였다. 이는 가수분해물에 용존되어 있는 비환원당과 올리고당류들이 에탄올 발효에서 중요한 역할을 하고 있음을 나타낸다. 가수분해 용액 대비 다시마의 주입비율을 1에서 5%(w/v)로 증가시킴에 따라 에탄올 농도는 2.4에서 9.2 g/L로 증가하는 반면 단위무게당 에탄올 생산량은 242에서 185 mg/g으로 감소하였다. 다시마의 에탄올 생산성은 대략 7,400~9,600 kg/ha/year 정도로 평가되어 다시마가 바이오에탄올 생산을 위한 바이오매스 자원으로 매우 유용함을 알 수 있었다.
알긴산은 미역이나 다시마 같은 갈조류의 세포벽에 존재하거나 또는 특정 박테리아들이 biofilm을 만들기 위하여 생산하는 L-${\alpha}$-guluronate 및 D-${\beta}$-mannuronate로 구성된 산성다당류이다. 전보에서 보고한 Sphingomonas sp. MJ-3의 외부 분해효소인 올리고알긴산 분해효소(oligoalginate lyase, MJ3-Oal)는 효소단백질의 N-terminal 영역에 내부 알긴산 분해효소인 polyM 분해효소의 단백질 서열과 상동성을 가지고 있었다. 본 실험에서는 MJ3-Oal이 외부 분해효소 활성뿐 만 아니라 내부 분해효소 활성도 함께 가지는 효소인지 알기 위하여 Saccharophagus degradans 2-40T 유래 올리고알긴산 분해효소인 Alg17c의 결정구조와 상동성 모델링을 행하였으며 기질과 수소결합을 할 것으로 예상되는 잔기 중 426번째 아미노산인 tyrosine을 구조가 비슷한 phenylalanine으로 돌연변이시키고 알긴산 분해양상을 wild type과 비교하였다. MJ3-Oal의 FPLC 결과를 보면 처음에는 이당류, 삼당류 등 올리고머가 증가하다가 최종적으로 단당류로 전환되었으나 Tyr426Phe 돌연변이 효소의 FPLC profile은 외부 분해활성만 나타내었다. 또한 $^1H$-NMR spectra 역시 MJ3-Oal은 polyM block 또는 polyMG block의 내부결합을 분해하는 활성을 나타내었다. 이와 같은 결과들은 Sphingomonas sp. MJ-3 유래 올리고알긴산 분해효소는 외부 분해효소 활성 및 내부 분해효소 활성 모두 가질 가능성을 뒷받침해 준다.
우리나라 전통발효식품의 하나인 청국장으로부터 고 비활성 세포외 protease 생산능이 우수한 균주를 분리하고 그 특성을 조사하였다. 분리된 균주 중 D14 균주 배양 상징액의 protease 활성이 15.2 U/mL로서 가장 강하였으며 비활성 또한 40.0 U/mg protein으로서 가장 강하게 나타났다. 이 균주의 특성을 조사한 후 Berge's Manual of Systematic Bacteriology에 준하여 Bacillus subtilis로 동정하였다. 균주 D14의 16S rDNA 염기서열을 분석하여 B. subtilis subsp. subtilis NCIB 3610 균주와 99.9%의 상동성을 가짐을 확인 하였다. 또한 16S rDNA의 염기서열을 토대로 계통분석을 통하여 다른 Bacillus sp.의 균주들보다 NCIB 3610 균주와 유전적으로 매우 가까운 관계에 있음을 확인하였다. Soluble starch는 사용한 탄소원 중 가장 높은 수준의 protease 생산능을 보였으나 단당류, 이당류 등은 모두 효소 생산능에 대하여 저해효과를 나타내었다. 특히 fructose를 첨가한 경우에는 12.7%, glucose를 첨가한 경우에는 35.9% 수준의 효소 생산능을 나타내었다. 질소원의 경우는 soytone의 첨가구에서 대조구에 비하여 약 61.4% 수준의 효소활성을 나타내어 저해효과가 가장 높았으며 다른 질소원은 효소 생산에 크게 영향을 미치지 않았다.
홍삼으로부터 홍삼알콜 추출물을 제조하고 부산물로 생성된 홍삼추출잔사로부터 한외 여과를 이용하여 홍삼산성다당체(RGAP, red ginseng acidic polysaccharide)를 대량으로 분리할 수 있는 방법을 개발하였다. 본 방법으로 홍삼추출잔사로부터 분리된 RGAP의 수율은 20.9%이었고, RGAP로부터 지표성분인 활성성분(GFP)의 분리수율은 39.4%이었다. 분리된 RGAP는 macrophage에 의한 NO(nitric oxide)를 생성하여 암세포를 사멸시키는 것으로 나타났다. RGAP를 BALB/c 마우스에 복강투여한 후 분리된 복강 macrophage를 P815 암세포(mastocytoma)와 함께 배양하였을 때 배지내의 NO 농도는 대조군에서 4.3 $\mu\textrm{m}$이었으나, RGAP 100, 300 mg/kg 투여군에서는 각각 9.8 및 25.3$\mu\textrm{m}$로 증가하는 경향을 나타내었다. 아울러 암세포인 P8l5세포의 사멸율도 정상대조군일 경우 7.3%이었으나 RGAP 100, 300 mg/kg 투여군에서는 각각 22.7 및 31.8%로 증가하는 경향을 나타내었다. RGAP을 2M의 TFA로 10$0^{\circ}C$에서 1시간 가수분해한 후 당 표준품과 TLC로 비교한 결과 당 표준품과 Rf치 및 발색 색깔이 일치하는 4개의 spot, 즉 rhamnose(Rf 0.78, 노란색 ), glucose(Rf 0.61, 녹색), galactose(Rf 0.56, 녹색), glucuronic acid(Rf 0.36, 황갈색)를 관찰할 수 있었다. 가수분해된 RGAP 분해산물을 Gl(glucose)부터 G7(maltoheptaose)까지의 당류와 함께 TLC를 행한 결과 진한 색상을 나타내는 spot은 Rf 0.56~0.61로 G2(maltose, Rf 0.46) 이상의 단당류(monosaccharide)인 것으로 나타났다. RGAP의 일부 이화학적 특성을 조사한 결과 pH는 4.74, 건조감량은 4.72%, 조단백질 함량은 3.30%, 회분은 4.74%이었고 중금속인 Pb는 2.30 ppm이었다.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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