실크 단백질과 녹색 형광 단백질을 결합한 순수 단백질 기반 녹색 형광체의 구현과, 산화티타늄 나노 입자에 의한 형광 증폭 현상을 보고한다. 실크 단백질은 인간에게 다양한 이점을 제공하는 소재로서, 다양한 마이크로/나노 구조 형성 가능성과 투명한 성질을 가지고 있어 광학소재로서의 활용 가능성 또한 높다. 본 연구에서 제작한 소재는 강한 녹색 형광을 띠고 있으며, 산화티타늄 나노 입자에 의해 녹색 형광이 7.5배 증폭되는 것을 확인하였다.
인간 게놈 프로젝트가 완료됨에 다라 생체서열과 언어 사이의 대응 관계가 부각되고 있다. 본고에서는 Lewis Carroll의 언어 유희 사례를 컴퓨터생물학의 측면에서 재조명하고, Carroll이 제시한 문제 중에서 간단한 anagram 문제의 해결을 다루고자 한다. 우선 DNA 컴퓨팅의 방법론을 적용한 DNAgram의 개념을 확장하여 plasmid-DNAgram의 개념을 새롭게 도입하였다. 이 개념을 형광단백질에 대한 DNAgram의 개념을 확장하여 plasmid-DNAgram의 개념을 새롭게 도입하였다. 이 개념을 형광단백질에 대한 FRET(fluorescent resonance energy transfer)분석기법의 응용 사례인 cameleon 형광단백질에 대한 FRET 분석기법에 적용함으로써 anagram 문제의 어휘론적, 구문론적, 의미론적, 화용론적 측면에 대응하는 바이오분자 컴퓨팅 방법론을 제안하였다.
처음으로 real time으로 유전자 발현을 visualization할 수 있는 marker를 이용할 수 있게 되었다. 이 maker가 바로 green fluorescent protein(GFP; 녹색형광단백질)이다. GFP는1962년 Shimomura 등에 의하여 해파리인 Aequorea victoria에 존재함이 밝혀졌다(1). 그러나 30년이 지난 1992년이 되어서야 Plasher등에 의하여 GFP의 cDNA가 클로닝 되었고(2) 이후 지금까지 약 10년 동안 GFP는 생명과학분야에서 가장 각광받는 유용한 단백질 중의 하나가 되어 매우 다양한 연구에 응용이 되고 있다. 이렇게 GFP가 생명과학분야에서각광을 받게 된 이유로는 GFP가 모든 외래의 세포에서 형광을 발할 수 있는 활성을 가진 형태로 발현되기 때문이다(3). Chalfie 등은 처음으로 GFP를 대장균과 Caenorhabditis elegans에서 발현시켜 유전자의 발현을 모니터함으로써 GFP를 원핵 및 진핵세포 모두에서 사용할 수 있다는 것을 보고하였다(3), 이러한 발견을 통하여 GFP는 살아있는 세포, 조직 및 생물체에 해를 주지 않고 (non-invasive) 유전자의 발현을 측정하는 marker로서 사용할 수 있게 되어 cell biology, developmental biology, neurobiology 및 cytology 등의 연구분야에 널리 이용되고 있다.
본 연구의 목적은 누에형질전환 기술을 이용하여 녹색형광실크를 개발하는 것으로서, 본 실험에서는 피브로인 H-chain의 N-말단과 C-말단을 이용하여 피브로인 재조합 단백질 발현 시스템을 제작하였고, 종결코돈이 없는 EGFP 유전자를 위의 발현 시스템에 클로닝하여 녹색형광실크를 제작하였다. 누에형질전환체 선발을 위해서는 3xP3 promoter와 DsRed2를 이용하여 선발하였고, 1200 개의 누에알에 microinjection 하여 F1 세대에서 8 bloods의 형질전환체를 선발하였다. 선발된 누에형질전환체는 초기배 단계의 눈과 신경조직, 유충과 번데기 그리고 성충의 눈에서 DsRed2 형광단백질이 발현되는 것을 확인 할 수 있었다. 또한 실크의 피브로인에서 EGFP 단백질이 발현되는 것을 확인하기 위해, F2세대의 누에형질전환체 중에서 5령 3일 유충을 해부하여 견사선을 형광현미경으로 관찰하였고, 중부와 후부 견사선에서 형광단백질이 발현되는 것을 확인할 수 있었다. 그리고 F2 세대의 고치와 저온에서 정련한 실크에서도 녹색형광단백질의 발현을 확인할 수 있었고, Western blot 분석에서도 EGFP 재조합 단백질이 피브로인 H-chain과 융합된 형태로 존재하는 것이 확인되었다. 이상의 결과에서 녹색형광실크를 생산하는 누에형질전환체가 성공적으로 제작 되었음을 확인할 수 있었고 이러한 결과를 토대로 새로운 산업소재로서 실크를 활용할 수 있을 것으로 기대한다.
Green fluorescent protein (GFPuv) was displayed on the surface of ethanol-producing bacteria Zymomonas mobilis using N-terminal domain of ice nucleation protein (INP) as an anchoring motif. To evaluate the ice nucleation protein as plausible anchor motif in Z. mobilis, GFPuv gene was subcloned into Zymomonas expression vector yielding pBBR1MCS-3/pPDC/INPN/GFPuv plasmid., INP-GFPuv fusion protein was expressed in Z. mobilis and its fluorescence was verified by confocal microscopy. The successful display of GFPuv on Zymomonas mobilis suggest that INP anchor motif could be used for future fusion partner in Z. mobilis strain improvement.
최근 국내 농촌진흥청 국립농업과학원 연구팀에서 농가보급품종인 백옥잠(잠123 ${\times}$ 잠124)을 이용하여 피브로인 중쇄 유전자 내에 녹색형광유전자(EGFP)를 도입하여 녹색형광 누에고치를 생산하는 형질전환누에 개발에 성공한 바 있다. 그리고 녹색형광 누에고치는 견사의 주성분인 fibroin heavy chain 유전자에 삽입된 형광유전자의 발현으로 정련을 해도 형광단백질의 고유한 색깔이 그대로 유지되며, 자연광 하에서도 도입 형광유전자 고유의 형광색을 나타낸다. 그러나 형광누에고치는 기존의 $100^{\circ}C$ 내외의 고온 처리에 의한 건조, 자견 및 조사 방법을 이용하면 형광단백질에 심각한 변성이 초래되고 이로 인해 형광색깔을 잃게 되는 단점을 가지고 있다. 따라서 본 연구에서는 녹색형광 누에고치로부터 녹색형광단백질의 변성을 초래하지 않는 누에고치의 저온건조 방법, 저온 진공 감압 처리에 의해 고치 내강 내 침지액 침투방법 및 조사방법을 개발하여, 녹색형광 누에고치로부터 천연의 녹색형광색을 띄는 생사를 생산하였다. 그리고 이들 생산된 녹색형광 생사는 별도의 염색처리 없이 패션의류, 벽지, 조명등갓, 액세서리, 인테리어용품 등의 고부가가치 실크소재로 적용이 기대된다.
폴리히드론 프로모터, 수포성구내염 바이러스G, 폴리A, 사이토메가바이러스 프로모터, 강화녹색형광단백질, 단백질전달부위 유전자 등을 포함한 새로운 베큘로바이러스 시스템이 제조되었다. 본 재조합벡터 시스템은 인간 섬유아세포에 적용하여 시험하였고 재조합된 유전자의 전달과 유전자 발현을 대조 벡터시스템과 비교하였다. 본 연구로부터 새롭게 제작된 본 베큘로바이러스 시스템이 유전자의 전이와 유전자 발현 면에서 대조 벡터시스템 보다 고효율을 나타내었다.
한국생물정보시스템생물학회 2004년도 The 3rd Annual Conference for The Korean Society for Bioinformatics Association of Asian Societies for Bioinformatics 2004 Symposium
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pp.64-73
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2004
세포 내에서 일어나는 신호 전달 과정은 단백질간의 상호작용을 통해 수행되고 조절된다. 단백질 상호작용 데이터를 활용하여 수행된 연구로는 단백질의 기능을 유추하거나 전체 네트워크 중 다른 지역보다 더 조밀한 상호작용을 추출하여 complex 혹은 pathway를 발견하고 진화 과정을 이해하는 바탕이 되고 있다. 본 연구에서는 신호 전달 경로에 대한 사전 정보 없이 yeast 상호작용 정보와 녹색형광단백질(GFP)을 이용하여 밝혀진 4000여 개의 yeast 단백질 위치 분포 data를 이용하여 신호전달경로를 찾는 방법을 시도했다. 기존 연구에 의해 밝혀진 yeast 내의 단백질 위치 분포 결과를 보면 21개의 category에 대해 각 단백질 상호작용 분포가 다양하게 나타나고, 특정 위치에서 상호작용 빈도수가 현저히 크다는 것을 알 수 있다. 특히 두 단백질이 같은 장소에 있을 경우 상호작용 확률이 높으며, 세포 내 소기관 사이에도 상호작용의 정도가 다양함이 알려져 있다. 따라서 이러한 분포상의 특성을 고려하여 상호작용을 기반으로 하여 세포막 단백질을 출발점으로, 핵에 있는 단백질을 도착점으로 잡고, 그 사이에 존재하는 다양한 가능 경로 중에서 단백질의 위치 정보를 가중치로 사용하여 그 중 최대 가능 경로를 찾도록 구현하였다. 이와 같은 pathway 모델링은 기존에 밝혀진 pathway와의 비교를 통해 알려지지 않은 새로운 경로를 발견하고, 이전에 경로에 참여하지 않은 단백질들을 발견할 수 있고, 이미 알려진 단백질들의 새로운 기능들에 대해서도 추론할 수 있을 것이라 기대한다.
세포 내에서 일어나는 단백질 신호 전달 과정은 단백질간의 상호작용을 통해 수행되고 조절된다. Yeast 상호작용 정보와 녹색형광단백질(GFP)을 이용하여 밝혀진 약 5,000여 개의 Yeast 단백질 위치정보를 이용하여 가중치를 부여하고 신호 전달경로 추출 및 예측을 위한 고성능 LocSPF 알고리즘을 최초로 제안하였다. 가중치 알고리즘에 의해 산출된 결과 중 의미 상관도가 높은 것을 채택한 후 KEGG에서 제공하는 신호전달 경로와 같은 신호전달 경로를 추출하는지 유사도 비교를 하였다. 한편 더 나아가 아직 실험을 통해 밝혀지지 않은 단백질 신호전달 경로를 예측하여 결과를 제시함으로써 본 연구를 통해서 알려지지 않은 새로운 신호전달 경로를 발견하거나 이전 경로에 참여하지 않은 단백질들을 발견할 수 있는 가능성을 제시 하였다.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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