• Clinical and Experimental Reproductive Medicine
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• 제33권4호
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• pp.265-272
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• 2006

목 적: 본 연구는 생쥐 포배기 배아로부터 내세포괴를 분리하는 방법과 지지세포의 종류와 mitomycin C 처리 시간이 내세포괴 colony 형성률에 미치는 영향을 관찰하기 위해 시행되었다. 연구방법: 일반적인 면역절제술, 주사바늘을 이용한 부분 영양막세포 절개법, 포배기 배아 공배양법으로 내세포괴를 분리한 후, 상업적으로 구입이 가능한 STO 또는 직접 제조한 생쥐 배아섬유아세포 (pMEF)를 지지세포로 이용하여 배양하였다. 또한, mitomycin C를 1, 2, 3시간 동안 처리한 각각의 지지세포에서 7일 동안 배양한 후, 내세포괴 colony 형성률을 살펴보았다. 결 과: STO 지지세포에서는 부분 영양막세포 절개법을 사용한 경우 (52%)가 면역절제술 (12%)이나 포배기 배아 공배양법 (16%)을 사용한 경우보다 내세포괴 colony 형성률이 유의하게 높았다 (p<0.05). pMEF 지지세포에서의 형성률은 부분 영양막세포 절개법을 사용한 경우 (88%)와 포배기 배아 공배양법 (82%)을 사용한 경우가 면역절제술 (16%)을 사용한 경우보다 높았다 (p<0.05). STO와 pMEF 모두에서, 2시간 mitomycin C 처리군 (52%, 88%)이 1시간 처리군 (9%, 42%)과 3시간 처리군 (18%, 76%)보다 높은 내세포괴 colony 형성률을 보여주었다 (p<0.05). 결 론: 이상의 결과는 부분 영양막세포 절개법이 생쥐 포배기 배아로부터 내세포괴를 분리하는 가장 효과적인 방법이며, 가장 적절한 mitomycin C 처리 시간은 2시간이라는 것을 보여준다. 그러나 이와 같은 부분 영양막세포 절개법의 효용성을 보다 명확하게 확인하기 위해서는 분리한 내세포괴를 계대배양하여 줄기세포주로서의 특성을 확인하는 실험이 추가적으로 필요할 것으로 생각된다.

• Clinical and Experimental Reproductive Medicine
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• 제30권4호
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• pp.293-298
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• 2003

목 적: 인간의 배아줄기세포는 전분화능과 영속성을 가지고 있어 발생 및 분화에 관련된 기초 연구 뿐 만 아니라 재생의학, 약물검색 등에서도 매우 유용한 재료로 이용될 수 있다.본 연구에서는 유전체의 변형이 배아줄기세포주의 확립 효율에 미치는 영향을 살펴보고자 비정상적인 포배기 배아에서 내세포괴를 분리하여 배양하였다. 연구 방법: 인간의 체외수정 및 배아이식술에서 공여 받은1개 또는3개의 전핵이 관찰되는 비정상 수정란 (n=20)과 착상전 유전진단에서 이수성이 확인된 배아 (n=27)를 대상으로 하였다. 일반적인 immunosurgery 방법으로 영양배엽세포들을 제거하고 내세포괴를 분리한 후 PMEF 혹은 STO feeder 세포위에서 배양하였다. 배아줄기세포의 배양시스템을 검증하기 위해서 이미 확립된 Miz-hES1 cell line을 동시에 같은 조건 하에서 계대배양하였다. 결 과: 비정상 수정란에서 발생된 포배기 배아에서 분리한 1개의 내세포괴가 배아줄기세포와 유사한 colony를 형성하였으나, 계대배양에는 실패하였다. 이수성 배아에서 발생된 포배기 배아의 내세포괴 배양에서는 두개의 colony가 계대배양 중에 영양배엽세포의 형태로 분화되어 미분화 상태를 유지하지 못하였다. 동일한 시기와 조건 하에서 계대배양된 Miz-hES1 cell line이 미분화상태로 유지됨을 karyotyping (46, XY)과 immunophenotyping (positive in SSEA-3 and -4)으로 확인하였다. 결 론: 본 연구의 결과에서 비정상 수정란과 이수성 배아에서 발생된 포배기 배아에서 유래한 내세포괴는 배아줄기세포주 확립 및 미분화 상태 유지 능력이 매우 저조한 것으로 여겨진다. 따라서, 인간의 배아줄기세포주를 확립하는데 있어 배아의 정상여부가 중요한 요소로 작용할 것으로 생각된다.

• 대한생식의학회:학술대회논문집
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• 대한불임학회 2004년도 제47차 추계학술대회
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• pp.39-39
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• 2004

• 한국발생생물학회지:발생과생식
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• 제12권1호
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• pp.77-86
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• 2008

본 연구에서는 LIF의 첨가가 분리된 할구 유래의 생쥐 배아줄기세포 확립에 미치는 영향을 살펴보았다. 과배란 유도된 BDF1 생쥐로부터 2-세포기의 배아를 회수하여 각기 LIF가 첨가되지 않은 배양액과 1,000, 2,500, 5,000 U/mL의 LIF가 첨가된 배양액에서 포배기 배아까지 배양하였다. 배양된 포배기 배아는 차별화 염색 방법을 이용하여 내세포괴와 영양외배엽의 수를 계수하였다. 2,500 U/mL의 LIF 첨가 시 대조군($21.0{\pm}4.0$ vs. $15.9{\pm}5.0$, P<0.01)과 1,000 U/mL의 LIF를 처리한 군($21.0{\pm}4.0$ vs. $16.6{\pm}4.9$, P<0.05)에 비해서 내세포괴의 수가 유의하게(P<0.05) 증가하였다. 배아줄기세포주 확립 배양액으로는 FBS 대신 20% KSR과 0.01 mg/mL의 ACTH를 사용하였다. 2,500 U/mL의 LIF를 첨가 시 배아줄기세포 확립 효율이 36.7%(11/30)로 가장 높은 효율을 나타내었다. 이러한 배양 조건을 기본으로 하여 2-와 4-세포기 배아의 단일 할구를 분리하여 각기 21.4%(3/14)와 4.0%(1/20)의 효율로 단일 할구 배아줄기세포주를 확립할 수 있었다. 단일 할구로부터 확립된 배아줄기세포주와 이들에서 분화된 배아체는 세포면역학적 염색 방법과 RT-PCR 방법을 통해 그들의 미분화 특성과 삼배엽성 분화 특성을 확인할 수 있었다. 결론적으로 배양액에 LIF를 첨가하여 포배기 배아의 내세포괴 수를 증가시킬 수 있었으며, 분리된 할구의 배아줄기세포주 확립 효율을 향상시킬 수 있었다.

• Clinical and Experimental Reproductive Medicine
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• 제35권1호
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• pp.49-60
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• 2008

목 적: 자궁내막조직에서 분리한 상피세포와 기질세포를 삼차원 공배양을 통한 탈락막화 유도에서 성호르몬과 TGF-${\beta}1$의 역할을 알아보고 2-세포기 생쥐배아와 탈락막화가 유도된 자궁내막세포와의 공배양을 통하여 포배형성율, 부화율, 포배기배아의 내세포괴와 영양막세포수 및 부착율을 알아보기 위해 시행되었다. 연구방법: 인간 자궁내막조직에서 분리된 기질세포와 상피세포의 표지인자인 cytokeratin과 vimentin에 대한 면역조직 화학염색을 실시하여 분리를 확인하였으며, 성호르몬 우세환경 (progesterone, estrogen)에서 분리된 세포를 단일배양 혹은 3차원 공배양을 통하여 RT-PCR법으로 TGF-${\beta}1$, 수용체-1, -2, integrin-${\beta}3$, prolactin의 발현을 조사하였다. 배양액군을 대조군으로 하여 2-세포기 생쥐배아와 탈락막화 유도와 유도하지 않은 인간 자궁내막세포와의 공배양을 통하여 포배형성율, 부화율, 부착율과 부화된 포배의 영양막세포와 내세포괴수를 비교하였다. 결 과: 상피세포 표지인자인 cytokeratin과 기질세포 표지인자인 vimentin을 이용하여 면역조직화학염색을 한 결과 각각 95% 이상에서 양성반응을 나타내어 자궁내막조직으로부터 상피세포와 기질세포가 성공적으로 분리되었음을 확인하였다. 분리된 상피세포와 기질세포를 단일배양에서는 성호르몬의 조건에 관계없이 TGF-${\beta}1$과 수용체 type-1, type-2, integrin-${\beta}3$, prolactin mRNA가 발현되지 않았다. 공배양에서는 progesterone 우세환경일 경우 TGF-${\beta}1$ 수용체 type-2를 제외한 모든 mRNA가 발현하였으나 estrogen 우세환경에서는 TGF-${\beta}1$ 수용체 type-2와 prolactin이 발현되지 않았다. 2-세포기 생쥐배아를 배양액군, 비탈락막군 및 탈락막군으로 나누어 공배양하였을 때 포배기 발달율은 차이가 없었으나 부화율 (92%)과 부착율 (82%)은 탈락막군이 유의하게 높았으며 (p<0.05), 비탈락막군의 공배양에서 다수의 영양막세포가 투명대를 완전히 빠져나오지 않은 상태로 부착한 비정상형태를 보였다. 부화된 생쥐 포배기배아의 내세포괴수는 탈락막화에 관계없이 공배양한 포배의 내세포괴수가 유의하게 많았으며 (p<0.05), 영양막세포수는 탈락막군에서 배양액군과 비탈락막군보다 유의하게 많았다 (p<0.05). 결 론: 자궁내막조직에서 상피세포와 기질세포를 분리하여 다시 삼차원적 공배양을 통하여 progesterone (100 nM), estrogen (1 nM)과 TGF-${\beta}1$ (10 ng/ml)을 첨가하면 체외에서 탈락막화를 유도할 수 있으며, 탈락막화를 유도한 자궁내막 세포와 2-세포기 생쥐배아를 공배양하였을 때 탈락막화가 부화율, 부착율 및 영양막세포수에 유효한 영향을 미치는 것을 알 수 있었다.

• Clinical and Experimental Reproductive Medicine
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• 제33권1호
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• pp.25-33
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• 2006

목 적: 본 연구에서는 착상전 생쥐 배아에서 분리한 할구를 이용하여 배아줄기세포주를 확립하고 그 효용성과 특성을 살펴보고자 하였다. 연구방법: 생쥐 (C57BL/6J)의 2- 또는 4-세포기 배아에서 투명대를 제거하고 할구를 분리하여 지지세포와 공동배양한 후 할구로부터 형성된 내세포괴를 분리하여 계대배양을 실시하였다. 계대배양 중인 세포주의 특성을 확인하기 위해 alkaline phosphatase 활성도와 표지 인자 및 관련 유전자 발현을 세포면역화학적 염색과 RT-PCR 방법으로 살펴보았다. 또한, 계대배양 중인 배아줄기 세포주의 염색체 분석을 실시하였다. 결 과: 전체적으로 2-세포기에서 분리한 할구와 4-세포기에서 분리한 할구에서 각각 3.0% (1/33)와 4.0% (1/25)의 효율로 배아줄기세포주를 확립할 수 있었다. 이는 4-세포기의 배아를 사용하였을 때의 16.7% (5/30)에 비해 현저하게 낮았다. 분리된 할구로부터 확립된 배아줄기세포주에서 SSEA-l 과 Oct-4의 발현을 관찰하였고, 이들에서 분화된 배아체에서 삼배엽성 분화 관련 유전자들의 발현도 확인할 수 있었다. 결 론: 본 연구에서는 동물모델을 이용하여 착상전 초기 배아에서 분리한 할구를 이용하여 배이줄기세포를 확립할 수 있음을 확인하였다. 지속적인 관련 연구를 통해 인간의 체외수정 및 배아이식술에서 배아의 파괴 또는 발생 능력에 손상을 주지 않고 새로운 인간 배아줄기세포주를 생산할 수 있는 방법을 개발하고 실용화할 수 있을 것으로 사료된다.