계란의 난각은 닭의 자궁에서 형성되는 복잡하고 고도화된 다층 석회화 구조이다. 본 연구는 닭의 산란연령에 따른 자궁내막조직의 변화 양상과 난각 형성에 관여하는 주요 유전자들의 발현 양상을 고찰하였다. 난각 형성과 관련하여 난각 단백질과 관련한 OCX-32, OCX-36, OC-17, OC-116 유전자와 난각 이온과 관련한 CALB1, SPP1, SCNN1G, ATP2A2, CA2, CALM1 유전자를 분석대상으로 하였다. 자궁내막조직의 현미경적 관찰 결과, 연령이 증가함에 따라, 자궁 섬모상피세포의 탈락 및 세포의 위축과 섬유화 진행양상이 심화되었다. 그러나 연령 증가에 따른 혈중 이온성분의 농도차이는 없었다. 자궁내막 상피세포의 텔로미어 함량 분석 결과, 산란연령이 증가함에 따라 텔로미어 함유율이 감소됨을 확인하였다. 대부분의 난각 형성 관련 유전자의 발현량은 산란연령에 따라 유의한 변화를 나타내었다. 일부 난각 단백질 관련 유전자의 발현량은 산란연령이 증가함에 따라 증가양상을 보였으나, 이들 유전자들 간의 상호 관련성은 유의한 관계를 보이지 않았다. 난각 형성 이온 관련 유전자인 ATP2A2, SCNN1G, CA2, CALM1 유전자 간에는 상호 밀접한 관련이 있는 것으로 나타났다. 또한 난각 단백질 관련 OCX-32 및 OCX-36 유전자는 대부분의 이온 관련 유전자들과 높은 정의 상관을 보였다. 따라서 OCX-32, OCX-36, CALB-1, ATP2A2, SCNN1G, CA2 및 CALM1유전자들이 난각 형성에 상호 협력하거나 또는 독립적으로 작용한다. 결론적으로 산란연령이 증가함에 따라 자궁내막세포의 손상이 일어나지만, 그럼에도 불구하고 정상적인 난각을 형성할 수 있는 이유는 난각 단백질 및 난각 형성 이온 관련 일부 유전자들이 발현을 조절하여 난각 형성의 항상성 유지하기 때문인 것으로 사료된다.
한국산 멧누에(Bomdyx mandarina)chorion 유전자의 형질 발현기구를 규명하기 위한 연구의 일환으로 본 실험을 실시했다. 멧누에의 난각구조를 주사형 전자현마경에 의해 관찰한 결과 매우 특이적인 구조가 인정되었다. 즉 원추상의 불규칙 돌기에 의한 돌기구조층과 이 돌기 구조층을 덮고 있는 한 층의 얇은 덮개 구조층이 그것이다. 2차원 전기영동법에 의해 chorion 단백질을 분석한 결과, 난각을 구성하는 주요 단백질 성분은 등전점 4~6, 분자량 6~30 kd로 밝혀졌다. 특히 특이난각구조와 관련된 특이단백질 성분을 검출하였으며 이들의 대부분은 고cysteine 단백질인 것으로 추정했다. 이상의 연구결과에 의해 멧누에 난각의 특이 구조 형성에 따른 유전자발현기구 규명을 위한 기초자료가 얻어졌다.
멧누에나방(Bombyx mandarina) 난각유전자의 형질발현기구를 규명하기 위한 연구의 일환으로 각형성과정에 있어서 난각단백질의 합성과정을 분석하였다. 난각단백질의 합성과정을 여포세포의 기난관배양에 의한 in vitro합성계에 의하여 분석한 결과, 합성과정은 8단계로 나눌 수 있었으며 SDS-PAGE 분석에 의해 17개 이상의 단백질 band로 분리되었다. 멧누에 난각단백질은 합성시기에 따라 3단계로 구분되며 초기에는 비교적 고분자 성분이, 합성의 중후기에는 비교적 저분자성분이 합성되는 등 난각단백질의 합성은 시기특이적으로 조절되었다.
조류는 발생학적 특성상 수정과 초기 배발생을 제외한 거의 대부분의 개체발생 과정이 난각 속에서 진행된다. 그러므로 수정란에 생명 공학적 기법을 적용하는데 있어서, 포유류의 경우 여러 생명공학 기법이 적용된 수정란은 초기발생을 위한 체외배양 이후 반드시 모체에 이식되어야 하지만, 조류의 경우 인공적인 체외배양 체계가 확립되어 있어야 생명공학 기법이 적용된 수정란을 개체까지 발생시킬 수 있게 된다. 닭의 난자는 난관 누두부에 배란 후 약 15분내에 정자의 침입을 받아 수정되어 난관 팽대부에 도달하면 1세포기 수정란이 된다. 그 후 수정란이 협부에 도달하면 최초로 분할이 일어나기 시작하여, 방란시에는 그 세포수가 60,000개에 이르게 된다. 한편, 계란의 형성 과정에서는 다량의 난황을 포함한 난자가 난관 누두부로 배란되어 정자와 만나게 되면 수정란으로서 계란 형성이 계속되고 정자와 만나지 못하게 되면 무정란으로서 계란 형성을 계속하게된다. 배란된 난자가 난관누두부를 거쳐 난관팽대부에 도달되면 난자는 농후난백에 의해 둘러싸이게 되고 난관혈부에 도달되면 난각막이 형성되고 수양성 난백이 침적하게 된다. 그 후, 난관협부를 지난 난자는 난관자궁부에 도달되면 20시간이상 그곳에 머물면서 난각형성이 진행된 다음 방란된다. 따라서 수정란에 외래유전자를 미세주입하여 형질전환 닭을 생산하기 위해서는 수정란을 암탉의 난관 내에서 최초 분할되기 전에 외부로 끄집어내어야 하며, 수정란에 외래 유전자를 미세주입한 다음에는 다시 암탉의 난관내로 이식해야 하지만 현재까지 그러한 기술은 확립되어 있지 못하다. 그렇기 때문에 모체의 난관 속에서 일어나는 배 발생과 그 이후 개체까지의 발생을 위하여 인공적인 체외배양 체계가 확립되어 있어야 한다. 따라서 본 발표에서는 형질전환 닭을 생산하기 위한 양질의 1세포기 수정란 획득 방법과 획득된 수정란의 체외 배양방법에 관하여 기술적인 측면에서 고찰 해보고자 하며, 그와 같은 배양 기술을 이용하여 외래유전자를 도입한 일련의 결과에 관하여 보고 하고자한다.
가금 사육 프로그램에서 경제적으로 중요한 형질에 잠재적인 후보 유전자의 식별 및 활용은 점점 더 중요해지고 있다. Ovocalyxin-32(OCX-32) 유전자는 닭의 9번 염색체에 위치하며, 난각을 형성하는데 중요한 역할을 한다. 본 연구의 목적은 한국 재래닭의 OCX-32 유전자 내 SNP의 유전자형 결정과 산란 형질과의 연관성을 분석하기 위해 수행하였다. PCR-RFLP 방법을 통해 한국 오골계 46수, 백색 46수, 회색 43수, 흑색 46수를 포함한 총 181수의 한국 재래닭 암컷 4종의 SNP을 분석하였다. 산란 형질은 시산일령, 시산난중, 산란율, 난중의 4가지 항목을 포함하여 측정하였다. OCX-32 유전자 내 c.494A>C SNP은 오골계의 산란율과 유의적인 차이를 나타냈으며(p<0.001), 백색 재래닭에서는 난중과 유의적인 상관관계가 있었다(p<0.05). c.267T>G SNP은 오골계의 난중과 유의적인 연관성이 나타났다(p<0.05). 하지만 회색과 흑색 재래닭에서는 유의적인 상관관계가 나타나지 않았다. 본 연구 결과, 한국 재래닭의 사육 프로그램에서 산란형질을 선발하는 마커로 사용되기까지 추후 더 많은 개체군을 통한 연구가 요구되나, OCX-32 유전자 내 c.494A>C와 c.267T>G의 단일염기변이가 한국 재래닭 중 오골계와 백색 재래닭에서 산란 특성에 따른 DNA 선발 마커로서 활용할 수 있을 것으로 사료된다.
형질 전환 닭 생산 방법들 가운데 목적 유전자 운반에 탁월한 능력이 있는 것으로 알려진 렌티바이러스는 배반엽 단계 수정란을 이용한 형질 전환 닭 생산 연구에 활발하게 이용되고 있다. 본 연구는 재조합 렌티바이러스를 이용하여 사람의 SOD-3 단백질이 닭의 ovalbumin 프로모터에 의해서 유도되는 형질 전환 닭을 생산하고자 하였다. 사람의 SOD-3 단백질은 호흡 과정에서 체내에서 생성되는 활성산소를 중화시키는 탁월한 기능이 있는 것으로 알려져 있다. 후보 병아리의 생산은 앞서 언급한 유전자를 가지는 $1{\times}10^6$ cfu/mL 재조합 렌티바이러스를 배반엽 단계 수정란의 미세 주입하고 대리난각 배양법을 이용하여 배양기에서 21일 동안 배양하는 방법으로 생산하였다. 유전자를 미세주입한 341개의 수정란에서 78수의 후보 형질 전환 병아리를 생산하였으며, 생산된 후보 형질 전환 병아리들의 유전 분석은 PCR 방법을 이용하여 검증하였다. 유전 분석 결과는 성 성숙에 이른 47수의 수컷들 가운데 2수의 정액에서 사람의 SOD-3 유전자가 존재함을 보였다. 이상의 연구 결과는 완전한 형태의 형질전환 닭 생산의 가능성을 보여주고 있다.
일반적으로 병아리의 성감별은 생식돌기 감별법이나 반성 유전 형질을 이용한 자가 성별법으로 이루어지고 있다. 이들 중 우모 발생 속도에 관여하는 만우성 유전자를 이용한 깃털 성감별법이 산업적으로 가장 널리 이용되고 있는데, 이는 발생 시 깃털의 형태적 차이로 쉽게 판별이 가능하기 때문이다. 그러나 깃털 자가 성별종의 계통 조성을 위하여 반드시 모계가 만우성이어야 하므로 깃털의 조만성이 생산 능력에 미치는 영향을 구명할 필요가 있다. 따라서 본 연구에서는 깃털 자가 성감별 계통으로 조성 중인 한국 재래닭 적갈색종 만우성 개체들과 조우성 개체들을 대상으로 이들 간의 생산능력의 차이를 비교 분석하였다. 조우성과 만우성 개체들의 번식 능력 분석 결과, 수정율과 부화율 모두에서 이들 간에 차이가 없는 것으로 나타났고, 발생 후 60주령까지 생존율에서도 두 집단 간에 차이가 없었다. 또한 성장 능력의 비교 분석에서 발생 시부터 50주령까지 모든 주령에서 집단 간 평균 체중의 차이는 없는 것으로 나타났다. 깃털의 조만성이 산란능력에 미치는 영향으로 초산 일령의 경우 조우성 개체들의 시산 일령이 만우성 개체들에 비해 평균 3일 정도 빨랐으나, 일계 산란율에 있어서는 조우성 개체와 만우성 개체 간에 차이가 없었다. 깃털의 조만성이 난질에 미치는 영향에 대해서도 난각색을 비롯한 난중, 난백 높이, 하우유니트, 난황색, 난각 두께, 난각 무게 및 난각 밀도 등 모든 난질 지표의 차이는 없는 것으로 나타났다. 결론적으로 한국 재래닭에 있어 깃털 조만성에 따른 생산 능력의 차이는 없는 것으로 사료되어, 이를 이용한 자가 성감별 계통 조성 시 깃털 조만성에 따른 생산능력의 영향은 고려하지 않아도 되는 것으로 판단된다.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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