갓김치, 배추김치, 열무김치, 깍두기로부터 348종의 유산균을 분리하여 각 김치 종류에 따른 유산균의 특징을 확인하였다. 열무김치의 유산균은 다른 3종의 김치에 비해 간균+단간균:구균의 비가 5.6:1로 구균의 함량이 적었다. Leuconostoc 속으로 추정되는 구균의 함량은 4종의 김치가 모두 유사하였으나 Lactobacillus 속으로 추정되는 간균과 단간균의 함량은 깍두기에서 60.7%로 높게 나타났다. 다른 김치에 비해 배추김치 유래 유산균 중 18.7%가 plasmid가 없었으나 plasmid를 지닌 유산균 중에는 열무김치 유래 유산균에 평균 $4.1{\pm}0.5$개의 plasmid bands가 나타났다. 세포 외 다당(EPS)을 5 mg/mL 이상 생산하는 유산균은 무를 주재료로 한 깍두기와 열무김치에 각각 11.1%, 10.9%로 갓김치와 배추김치보다 많았지만 배추김치 유래 유산균이 $8.4{\pm}2.0mg/mL$의 EPS를 생산해 다른 김치 유래 유산균들보다 1 mg이상 높았다. 갓김치에는 V. parahaemolyticus에 대한 항균력을 지닌 유산균이 많은 반면 열무김치, 배추김치, 깍두기에서 Bacillus 속, L. monocytogenes, Salmonella Typhimurium에 대해 항균력을 지닌 유산균이 갓김치보다 2배 이상으로 나타났다. 열무김치와 깍두기 유래 유산균 중 43.3%, 45.5%가 내산성을 지녔으며, 특히 깍두기의 유산균 중 36.3%가 내담즙성을 나타내 다른 김치보다 많았다. Caco-2 세포에 대한 장내부착능을 지닌 유산균은 18.6%의 비율로 갓김치에 가장 많았다. 이러한 결과에서 볼 때, 김치에 함유된 유산균은 종이 한정적임에도 불구하고 김치 종류에 따라 각 김치에 함유된 유산균의 생물학적 특징에 차이가 있었으며, 특히 내산성, 내담즙성, 장내부착능을 지닌 유산균이 김치에 따라 차이가 나타남으로써 본 연구의 결과가 프로바이오틱 기능성을 지닌 유산균을 선별하는데 유용한 자료가 될 것으로 기대된다.
recA 유전자를 특이적으로 증폭하는 PCR을 이용하여 우리나라 전통 침채류 발효에 관여하는 유산균의 다양성을 검토해 보았다. 김치에서 많이 검출되는 유산균 7종 및 대조군으로 Lactobacillus acidophilus를 검출할 수 있는 특이적 PCR primer pair을 이용하여 전통 침채류 5증(갓김치, 동치미, 배추김치, 오이소박이, 총각김치로부터 추출한 DNA를 template로 PCR을 수행한 결과, 5종의 침채류 모두에서 Lactobacillus plantarum과 Lactobacillus sakei가 검출되었지만, Lactobacillus paraplantarum, Lactobacillus pentosus와 대조군인 Lb. acidophilus는 검출되지 않았다. Lactobacillus brevis와 Leuconostoc citreum은 배추김치에서만 검출되었으며, Leuconostoc mesenteroides의 경우 갓김치, 동치미, 배추김치, 오이소박이에서 검출되었다. 주재료의 종류에 따라서 발효에 관여하는 유산균은 차이가 있는 것으로 추정되며, Lb. plantarum과 Lb. sakei가 우리나라 침채류 발효에 가장 널리 관여하는 것으로 사료된다.
전남 목포의 각 가정에서 담근 김치로부터 분리된 총 56균주의 유산균 중 14균주가 pH 2.5인 인공위액에 내성을 나타냈다. 이 내산성 유산균은 인공위액에서 2시간 배양할 경우, 초기 유산균수의 수 $10^9/mL$에서 유산균수가 $10^7{\sim}10^9/mL$의 범위를 나타냈다. 김치로부터 분리된 내산성 유산균 AK 3, AK 7, BK 28 그리고 DK 37균주들은 초기 생균수에 비해 인공위액에서 2시간 진탕 후의 생균수가 감소하였지만, 그 생존율이 59-77%를 나타나 다른 유산균에 비해 인공위액에 대해 비교적 높은 내성을 나타냈다. 내산성 유산균으로 배양한 요구르트 5종류는 전체적으로 pH는 $3.78{\sim}4.32$ 사이였으며, 산도는 $0.96{\sim}1.41%$, 그리고 점도는 $1,659{\sim}2,348cps$로 나타났다. 요구르트의 유산균 생균수는 $1.1{\times}10^9{\sim}2.1{\times}10^9\;cfu/mL$의 범위를 나타냈다. 내산성 유산균 BK 28이 다른 균주에 비해 pH 3.78, 산도는 1.41%를 나타내었고 점도가 2,348 cps로 가장 높게 나타났다. 산성 유산균의 ${\beta}-galactosidase$ 활성은 경시적으로 효소활성이 증가하는 경향을 나타냈으며, 48시간에 최고의 활성도를 나타냈지만 그 이후에는 감소하는 경향을 나타냈다.
김치유래 유산균 단호박 발효음료의 개발을 위해 김치에서 유산균 19종을 분리하였다. 이후 진행된 인공 위액 및 인공 담즙산 실험에서 살아남은 유산균 1종을 선별하였고 이를 C332라 명명하였다. 이 C332는 앞으로 진행되는 모든 실험에서 종균으로 사용하였다. C332는 인공 위액에서 1.66 ${\times}$$10^5$ CFU/m${\ell}$, 담즙산에서 1.49 ${\times}$$10^6$ CFU/m${\ell}$ 만큼의 생균수를 측정하였다. C332를 단호박 배지에서 호기적과 혐기적으로 배양한 결과 광밀도, pH에서 큰 차이를 발견하지 못하여 통성혐기성 미생물임을 확인하였고, E.coli에 대한 항균활성 측정결과 14 mm의 클리어존이 생겨나 E.coli에 대한 항균활성을 확인하였다. 발효가 끝난 단호박 배지는 pH가 3.8까지 떨어졌으며, 산도는 1.41%이다. 16s rRNA full sequencing을 통해 C332는 Lactobacillus plantarum으로 동정되었다. 이후 관능검사를 통해 발효 시간별, 농도별로 발효음료가 유의수준 5%로 유의성이 있음을 검증하였다. 저장성평가를 통해 12일간의 저장기간 중 약간의 산도증가 경향과, 약간의 pH 저하경향을 확인하였고, 우리나라 호상요구르트의 유산균 기준치 (1.0 ${\times}$$10^8$ CFU/m${\ell}$)를 상회하는 생균수 (발효 후 경과 12일 1.15 ${\times}$$10^8$ CFU/m${\ell}$)를 확인하여 저장성이 우수한 것으로 나타났다.
분자생물학적 방법에 의한 김치유산균 연구의 진행으로 Leuconostoc, Lactobacillus, Weissella 속 유산균의 김치발효 과정 중 생육에 대한 새로운 결과들이 도출되었지만, Pediococcus속의 생육에 대한 새로운 결과는 거의 보고되지 않았다. 본 연구에서는 김치에 존재하는 Pediococcus 속 유산균의 존재에 대한 재조명을 위하여 ampicillin (A)의 첨가로 pediococci의 선발 유효성이 향상된 것으로 보고된 pediococci selective medium(PSM)+A를 이용하여 pediococci 선택적 검출의 유효성을 검토한 결과, 기존에 보고된 결과와는 달리 Pediococcus pentosaceus 외에도 leuconostocs, Lactobacillus casei, Lactobacillus curvatus, Oenococcus oeni, Streptococcus thermophilus에 대한 생육저해가 발생하지 않았다. PSM+A 한천배지를 이용하여 김치에 생육하는 미생물을 검출한 경우, leuconostocs, P. pentosaceus, Weissella koreensis, Lb. curvatus, Lactobacillus brevis, Lactobacillus sakei가 생육하여 김치와 같은 발효침채류의 발효에 관여하는 pediococci의 선택적 선발에는 PSM+A가 유효하지 않은 것으로 확인되었다.
백김치로부터 분리된 유산균으로 제조된 요구르트를 냉장 보관하는 동안 미생물학적 및 물리화학적 특성 및 Helicobacter pylori ATCC 43504에 대한 항균 활성을 조사하였다. 요구르트의 유산균수, 적정산도, 점도 및 총 고형물 함량은 사용된 균주에 따라 유의적인 차이가 있었으나, 발효 직후부터 7일간 저장하는 동안 유의할만한 차이 없이 일정하게 유지되었다. Lactobacillus brevis BK11과 Lactobacillus paracasei BK57 균주로 발효시킨 요구르트는 인공 위액과 담즙액에 대해 다른 균주들 보다 강한 저항성을 보였다. 한편, 이들 유산균으로 제조한 요구르트 내에 존재하는 유산 생성량은 상대적으로 높았으므로 H. pylori와 혼합 배양한 결과 대조구에 비해 유의적인 항균 효과를 나타낸 것으로 추정되었다. 특히, L. brevis BK11에 의해 발효시킨 요구르트에 의해선 AGS 세포에 대한 H. pylori의 부착을 억제할 수 있었고, 이들이 생산하는 urease의 활성을 낮추는데도 효과적이라는 것을 확인하였다.
본 연구는 H. pyroli 억제능을 지닌 김치 유래 유산균인 Pediococcus pentosaceus MD1을 가지고 궤양 예방효과를 지닌 김치를 개발하기 위한 선행연구로서 독성평가 실험을 수행하고자 4주 반복 투여 독성시험을 실시하였다. 본 시험에서 설정한 최고 용량 투여군인 2,000 mg/kg에서도 일반증상관찰, 체중변화, 사료섭취량 및 물 섭취량을 측정한 결과, 모두에서 시험물질과 관련된 유의성 있는 변화가 관찰되지 않았다. 또한 혈액학적, 혈액생화학적 검사 및 장기의 육안적 관찰 및 장기 중량변화에서도 대조군과 유의성이 있는 차이를 보이는 항목이 없었으며, 모두 정상범위를 벗어나지 않아 시험물질에 기인하는 이상소견을 발견할 수 없었으므로, 최대 무해 용량은 2,000 mg/kg 이상일 것으로 추정되었다. 이상의 결과 4주 반복 투여 독성시험 결과 H. pyroli 억제능을 지닌 유산균인 Pediococcus pentosaceus MD1은 저독성물질로 판정되었으며, 유산균이 기능성식품 소재로서의 안전성 확인을 통하여 소비자들에게 소화성 궤양 예방효과를 지닌 안전하고 차별화된 경쟁력 있는 김치를 개발할 수 있을 것으로 사료된다.
본 실험에서는 오디와 실크 단백질을 첨가하고 식물성 젖산균인 Lactobacillus plantarum와 Bacillus acidiproducens로 발효시킨 기능성 발효유를 제조하고 이들의 발효유의 물리화학적 품질을 조사하고자 한다. 제조한 발효유의 물리화학적 특성과 품질은 발효유의 총 페놀 함량 및 안토시아닌 함량, 점도, 색도 값을 측정하고 기호도를 조사하여 결정하였다. LP와 BA로 제조한 발효유는 대조균주인 YF과 유사한 pH와 산도를 나타내었으나, 오디와 실크 단백질을 첨가한 발효유는 유의적으로 낮은 pH값와 높은 산도를 나타내었다. 발효유의 색도는 오디와 실크 단백질을 첨가한 발효유에서 높은 적색도와 낮은 명도, 황색도 값을 나타내었고, 생균수와 점도에서도 오디와 실크 단백질을 첨가한 발효유에서 높은 값을 나타내었다(p <0.05). 생균수의 경우 BA + MS, LP + MS, YF, BA, LP순으로 높은 값을 나타내었는데, YF를 기준으로 오디와 실크 단백질을 첨가한 발효유와 첨가하지 않은 발효유간의 유의적인 차이를 보였다. 관능평가에서도 오디와 실크 단백질을 첨가한 발효유에서 높은 선호도를 보였으며, 전체적인 기호도에서는 BA + MS, LP + MS, BA, YF, LP 순으로 높은 점수를 받았고 식초에서 얻은 균으로 제조한 발효유가 높은 선호도를 보였다. 결론적으로 김치 및 식초 유래 유산균으로 발효유는 기존에 상업적으로 사용하는 유산균으로 제조한 것과 물리화학적 특징에 차이가 없었다. 더 나아가 오디추출물과 실크 단백질을 첨가한 발효유는 오디추출물과 실크 단백질이 첨가되지 않은 발효유보다 물리화학적 품질도 향상되고, 기호도도 높여서 향후 제품화 가능성도 기대할 수 있겠다.
해조류의 발효가 가능하고 probiotic 특성이 우수한 유산균을 분리 선발한 후 이들의 미역과 다시마 발효능을 검토하였다. 미역 및 다시마 발효가 가능한 균주를 김치 젓갈, 된장으로부터 331 균주를 순수 분리하여 해조류 구성 다당(alginate, cellulose) 분해능, 균의 생육, 항균 활성 등을 비교 검토한 결과 4균주(stain No. 162, 164, 192, 196)가 우수하였다. 선발 균주 모두 인공위액, 인공담즙액, NaCl에 높은 생존율을 나타내었고 이들 4균주 중 No. 192가 가장 우수하였으며 Enterococcus faecium으로 동정되었다. 미역과 다시마를 이용하여 선발 유산균을 배양한 결과 No. 192 균주가 발효특성이 가장 양호하였으며, No. 162, 164, 196 균주도 양호하였다. 선발 유산균을 이용한 미역과 다시마에서 성장이 가능하였으며 발효 후 미역과 다시마 발효물의 항산화 활성이 증진되었다.
배추김치 제조 후 익힘 시간 및 김치 냉장고 저장 기간에 따른 김치의 위 암세포 증식 억제 효능 변화를 측정해 본 결과, 저장 30일 김치 시료 기준으로 익힘 과정을 거치지 않은 S0h 시료에 비하여 46시간의 익힘 과정을 거친 S46h 시료의 효능이 가장 우수하였고, 이어서 S47h, S48h 시료의 효능이 우수하였다. 그리고 S0h 경우는 상대적으로 암세포 증식 억제 효능이 가장 약하였다. 이는 적정 발효에 따른 발효 대사산물, 그리고 유산균 속 및 종 변화에 기인한 결과로 판단되며, 항암 효능 보유물질로 알려진 GABA의 농도와도 연관이 있을 수 있음을 제안해 주고 있다. 김치는 다양한 재료 유래의 기능성 물질, 대사산물 및 유산균을 보유하고 있는 발효식품이다. 따라서 본 연구는 김치제조 후 최적의 숙성 시간과 저장 기간을 선택하면 항암 기능성이 증진된 김치를 섭취할 수 있는 것을 제안해 주고 있다.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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