Anti-inflammatory Effect of Herbal Complex HP-04 on Degenerative Osteoarthritis

해동피를 포함한 생약복합제제 HP-04의 퇴행성 골관절염에 대한 항염효과

Abstract

To investigate the anti-inflammatory effect on Degenerative Osteoarthritis, Male sprague-Dawley rats were randomized and classified into three different concentration groups. We measured weekly weight change, dietary intake, drinking water intake, blood analysis like TNF-α (tumor necrosis factor-α), IL-6 (interleukin 6), TIMP-1 (tissue inhibitor of metalloprotease-1), MMP-2 (matrix metalloprotease-2), MMP-9 (matrix metalloprotease-9) and micro CT analysis. The results suggest that the treatment with herbal complex HP-04 improved the Monosodium iodoacetate (MIA) induced degenerative osteoarthritis and it could be applicable for the improvement of arthritic symptoms as a new therapeutic agent.

골 관절염이란 뼈의 끝부분을 덮고 있어 뼈를 보호해주는연골이 닳아서 없어지는 상태를 가리키는 말로, 관절 질환 중 가장 흔한 질환이며, 나이가 들면서 증가하기 때문에 퇴행성 관절염 이라고도 불린다. 일반적으로 40세에 이르면 대부분에서 관절의 퇴행성 변화가 나타나며 60세 이상이 되면 50% 이상에서 퇴행성 관절염의 증상이 나타나는 것으로 되어 있는데 이때 관절의 병변은 매우 다양하게 나타나며 아직 그 원인에 대해 기전이 명확하게 규명이 되지 않고 있으나 선천적 결함이나 외부 자극으로 인한 연골 세포의 손상 등으로 일부 설명 될 수 있다. ¹⁾ 현재 퇴행성 관절염의 근본적인 치료 방법은 없으나 관절염 환자의 치료는 대증 요법으로서 통증 및 연골 손상을 억제하는 acetaminophen, ibuprofen, indomethacin과 같은 비스테로이드성 항염제(NSAIDs; non-steroidal anti-inflammatory drugs)가 일반적으로 사용되는데 이러한 약물들은 cyclooxygenase-2(COX-2)의 활성을 억제하고 prostaglandin E2의 합성을 감소시켜 항염 작용과 통증 억제 작용을 하지만 이 약물들은 소화기계, 신장, 심혈관계 및 혈액 응고 기전 등의 부작용을 가지고 있으며 장기 복용 시 속쓰림과 위출혈 등을 유발할 수 있다.^2-4) 이러한 기존 약물들의 단점을 보완하기 위해 보다 안전성이 뛰어난 천연물을 활용한 치료제 및 건강식품을 개발하려는 노력이 최근 활발하게 진행 되고 있다.^5-7) 본 연구에서는 관절염 예방 효과를 기대할 수 있는 새로운 생약 조성물을 도출하기 위하여 항염, 진통, 사이토카인 억제, 면역기능 조절, 골관절염 및 류마티스 관절염에 효능이 보고된 생약을 조사하여 신규 조합물을 도출 하였다. 신규 조합물은 6가지 생약으로 구성되어 있으며 이 중 해동피(Kalopanax pictus Nakai)는 두릅나무과 음나무(Kalopanax pictus Nakai)의 나무껍질로써 동의보감에서는 허리나 다리를 쓰지 못하는 것과 마비되고 아픈 것을 치료한다고 하였으며, 거풍습(祛風濕), 통경락(通經絡)의 대표적인 약재로써 무릎, 허리, 관절 등 사지 저림과 통증을 치료하는데 사용되었고 해동피의 성분으로서 사포닌인 kalopanaxsaponin들과 liriodendrin, syringin 등의 성분이 알려져 있으며, ^1,2) 류마티스 관절염 동물모델에서 진통 및 항염 효과를 보고하였다. ³⁾ 모과(Pseudocydonia sinensis)는 감기나 기관지염에 많이 사용되며 폐렴 류머티즘에 효능이 있는 것으로 알려져 있고, 동의보감에서는 간(肝)에 들어가며 근골(筋骨)을 강하게 하고 모든 근병(筋病)에 좋다고 기록하고 있다. 모과의 성분으로는 procyanidin, chlorogenic acid, catechin, epicatechin 등이 보고되어 있다. ⁴⁾ 당귀(Angelica gigas Nakai)는 산형과 참당귀의 뿌리로써 한방에서는 피를 보하고 혈액순환을 돕는 약재이며 함유성분으로는 decursin, decursinol angelate, nodakentin, nodakenin, umbelliferon, β-sitosterol, α-pinene, limonene 등이 알려져 있고, ⁵⁾ 염증성 cytokine 발현 억제를 통한 골관절염 효과를 보고하였다. ⁶⁾ 삼백초(Saururus chinensis Baill)는 삼백초의 뿌리와 전초를 건조한 것으로써 전통적으로 부종, 각막, 황달, 백혈병, 요로 감염, 고혈압 치료에 사용되었고, 항염증, 항 종양, 항산화, 멜라닌 합성 억제, 간 보호 및 뼈 보호 활성 등이 보고되었다. ⁷⁾ 내복자(Raphanus sativus Linne)는 십자화과 무의 종자로써 변비, 만성 기관지염 및 고혈압 치료 등이 보고되었다.^8,9) 생강(Zingiber officinale)은 대표적인 향신료 중 하나로 한의학에서는 건위제, 구토, 복통, 설사 등의 치료에 사용되었다. 위보호 및 항궤양 효과와 대장염 억제 효과 등을 나타내는 것으로 보고되었다. ^10,11) 본 연구에서는 상기 6가지 생약을 일정 비율로 혼합한 해동피 추출물 등 복합물(HP-04)의 퇴행성 골 관절염에 대한 효과를 확인해 보기 위하여 MIA로 유도한 골 관절염 동물모델에서 염증 억제 효능과 관절염 개선 효과를 확인하고 유의미한 결과를 얻어 보고하고자 한다.

재료 및 방법

추출물 제조 및 시험물질의 조제

본 실험에 사용한 천연 기능성 복합 처방은 한풍제약에서 제공 받아 사용하였으며, 6가지 생약은 대한민국약전 및 대한민국약전 외 한약(생약) 규격집의 시험법에 따라 시험하고 검증된 생약을 사용하고 각 생약 표본은 한풍제약에서 보관 중이다. 각 생약 원료에 10배수 또는 20배수의 물을 넣고 2회 환류 추출 후 추출액을 여과하고 그 여과액을 감압 농축, 건조하여 각각의 건조 분말을 얻었으며 각각의 추출 분말은 Table I과 같은 비율로 혼합하여 해동피추출물 등 복합물(HP-04)을 제조하였다. HP-04는 시험에 사용하기 전 증류수에 녹인 후 zonde로 시료를 시험 동물에 21일간 투여하였으며 시험 물질은 밀봉하여 냉동 보관하였고, 투여 시 1주일 분량을 제조한 다음 1일 투여량에 맞게 분주한 뒤 냉장 각각 보관하였다.

Table I. The Composition of natural functional complex formulation

실험동물 및 사육 환경

실험동물은 8주령 무게 300-370 g의 male SD rat(Orient bio, Kyenggi, Korea)을 사용하였다. 동물 입수 시 모든 동물의 일반 건강상태에 대한 수의학적 검역을 실시하였으며, 시험을 실시하는데 적합하도록 1주일간의 순화 기간을 거쳤다. 실험실의 환경은 온도 22±2℃, 습도 50±10%, 환기는 10회/시간. 전배기방식을 사용하였으며 조명 시간 및 명암 주기는 12시간 점·소등(조명: 오전 7시~오후 7시) 하였고 조도는 150-300Lux이었다. 사육 기간 중에 식이는 일반 고형 사료(Samtako, Gyunggi, Korea)를 공급하였으며 음수는 여과 된 음용수를 매일 교체하였다. 시험 군 별 식이와 음수는 자유롭게 섭취하도록 하였다.

관절염 유도 및 시험군 구성

순화 기간이 끝난 시험 동물은 0.9% sodium chloride으로 희석한 MIA(monosodiumiodoacetate)를 insulin 주사기를 사용하여 오른쪽 무릎 관절강 내에 50 μl(3 mg/ml)씩 주입하여 관절염을 유발하였다. MIA 투여 3일 후 관절 염 임상 지수를 이용하여 골관절염이 유발된 시험동물만을 선별한 다음 난괴법으로 각 시험군간 임상지수 값이 균일 하도록 분리하고 ear punch를 이용해 개체 식별 표시를 하였다. 동물 시험에 사용한 시험군은 다음과 같다(Table II). 실험군은 관절염을 유발하지 않은 정상군(Normal group), 관절염을 유도한 후 시료를 처리하지 않은 대조군(Control group), 관절염을 유도한 후 저농도 50 mg/kg 투여한 시험군, 관절염을 유도한 후 중농도 100 mg/kg 투여한 시험군, 관절염을 유도한 후 고농도 200 mg/kg 투여한 시험군으로 군당 10 두씩 구성하여 각 시료를 21일 동안 경구투여 하였으며 본 동물실험은 동물실험윤리규정을 준수하여 수행하였다(IV-RB-02-1904-04).

Table II. The composition of experimental group and dosage

체중 변화량 및 식이 섭취량과 음수 섭취량 측정

시료 투여 후 체중은 주 1회 간격으로 측정하여 그 변화량을 측정하였으며 식이 섭취량과 음수 섭취량도 그 변화를 측정하기 위하여 시료급여 후 익일 잔량을 측정하여 주 1회 마다 일정한 시간에 그 변화량을 측정하였다.

관절염 임상 지수 분석

관절염 임상지수는 Yang 등¹²⁾의 방법을 응용하여 4명의 실험자가 독립 관찰하여 각 시험군별 시험동물의 슬관절 부종 및 절곡 현상을 관찰하였고, 변화 없음을 0점으로 하고 그 심각도 정도에 따라 1점부터 3점으로 배점하였으며 각 점수는 평균값으로 표시하였다(Table III).

Table III. The grade and arthritis clinical index

체중 부하 검사

뒷다리 체중 부하는 Incapacitance Meter Tester를 이용하여 측정하였는데 그 방법은 플라스틱 방에 60도 기울기로 세운 후, 각 뒷다리에 가해진 세기를 10초에 걸쳐 평균을 산출하였다. 이때 처치된 동측의 뒷다리에 분포된 체중의 백분율은 다음과 같은 방정식을 이용하여 계산하였다.

백분율(%) = {(유발된 하지의 무게)/(정상 하지의 무게)}×100

부검 및 혈액 분석

치료 종료 후 모든 rat을 부검하였는데 부검은 흡입 마취 후 복대정맥에서 채혈하여 혈액 분석에 사용하였으며, 슬관절을 분리하여 포르말린 고정 후 조직 분석에 사용하였다. 채혈한 혈액은 상온에서 30분 응고시킨 후 1000 rpm에서 3분간 원심 분리하여 혈청을 회수하였으며 회수한 혈청은 ELISA kit를 이용하여 TNF-α(tumor necrosis factor-α), IL-6(interleukin 6), TIMP-1(tissue inhibitor of metalloprotease-1), MMP-2(matrix metalloprotease-2), MMP-9(matrix metalloprotease-2) 분석에 사용하였다.

Micro CT 분석

Micro-CT 측정은 Quantum FX Micro-CT(Perkin Elmer, USA)를 이용하여 관전압 90 kVp, 관전류 160 μA, FOV 10 mm로 설정하여 3분간 촬영하였고, 영상 분석은 Analyze 12(Mayo Clinic, USA)을 이용하였다. 본분석은 실험종료 후 각 군별 1두씩을 선별하였고, Volume 렌더링을 수행하여 반월상 연골을 분리한 후, 3D 영상을 획득하였다.

병리조직학적 분석

Micro-CT arthrography 촬영이 끝난 후 실험 쥐의 무릎 부위를 절단하여 10% EDTA가 포함된 10% 포르말린 용액에 넣어 관절 조직을 탈칼슘화(decalcification) 하였다. 이 후 파라핀으로 고정된 조직을 7 μm의 크기로 자른 뒤, Hematoxylin and Eosin(H&E) 및 Safranin-O 염색을 실시한 후 그 결과를 광학 현미경하에서 관찰하였다

통계 분석

모든 실험 결과는 평균±표준오차(Mean±S.E.)로 계산하였다. 각 군 간의 통계적 유의성 검정에 따른 통계 분석은 ANOVA(one-way analysis of variance test)Duncan 사후 검정 비교를 실시하여 p<0.05일 때 유의한 것으로 판정 하였다(SPSS V12., SPSS Inc, Chicago, IL, USA).

결과 및 고찰

체중 변화량 및 식이 섭취량과 음수 섭취량의 측정

MIA로 골 관절염을 유도한 동물 모델에 HP-04가미치는 영향을 확인하기 위하여 먼저 각 시험군 별로 주간 체중량을 측정한 결과는 다음과 같다. 시험 종료 시점인 3주차에 각 시험군 별 체중은 정상군(Normal)이 433.3±4.2 g, 대조군(Control)이 433.8±6.5 g, 저농도 투여군(HP-04 50)이 438.7±3.3 g, 중농도 투여군(HP-04 100)이 449.2±10.7 g, 고농도 투여군(HP-04 200)이 436.9±7.6 g으로 군간 유의적인 차이는 없는 것으로 확인되었다(Fig. 1). 또한, 투여 시료가 골 관절염 동물 모델의 주간 식이 섭취량과 음수 섭취량에 미치는 영향을 확인한 결과 정상군에 비해 대조군을 비롯한 시험군의 식이 섭취량이 다소 높은 경향을 보였으며, 음수의 경우 대조군이 타 시험군에 비해 낮게 조사되었으나 유의적인 차이는 없는 것으로 나타났다(Fig. 2).

Fig. 1. Effect of samples on weekly weight in MIA-induced osteoarthritis animal model. Low group (50 mg/kg), Mid. group (100 mg/kg), High group (200 mg/kg).

Fig. 2. Effects of samples on weekly diet and drinking intake in MIA-induced osteoarthritis animal models. A: Dietary Intake, B :Drinking Water Intake.

관절염 임상 지수 및 체중부하

골 관절염에 대한 천연 기능성 복합 처방의 효능을 확인하기 위해 관절염 임상 지수를 평가하여 분석하여 보았다. 분석 결과 MIA 유도를 하지 않은 정상군(Normal)은 관절에서 특이한 증상이 관찰되지 않았으나, MIA로 골 관절염을 유도한 대조군(Control)의 경우 발을 딛지 못하고 절뚝거리는 현상이 심하게 관찰되었다. 대조군의 이러한 증상은 시간이 경과함에 따라 감소하였으나 크게 호전되지 못하여 시험 종료차인 21일에는 1.6±0.1점으로 비교적 높게 나타났다. 반면 HP-04를 투여한 시험군은 MIA 투여 후 시간이 경과함에 따라 대조군에 비해 증상이 완화되는 것으로 나타났으며, 저농도(HP-04 50)와 중농도 투여군(HP-04 100)은 MIA 투여 직후 대조군과 큰 차이를 보이지 않았으나 18일차부터 증상이 호전되어 21일차에는 각각 1.4±0.1점, 1.4±0.1점으로 나타나 대조군과 유의적인 차이를 보였다. HP-04 고농도 투여군(HP-04 200)은 대조군과 비교하여 7일차까지는 유의한 차이를 보이지 않았으나 11일차부터 그 지수가 낮아지는 경향을 보이기 시작하였고 18일차부터는 그 지수가 유의하게 낮아져 21일차에는 1.0±0.1점으로 시험군 중 가장 낮게 조사되었다(Fig. 3A). 이러한 결과는 HP-04가 MIA로 유발된 관절염을 개선시켜 항염 및 진통 효능을 나타낸 것임을 시사한다.

골 관절염 모델에서 HP-04의 효능을 확인하기 위해 각 시험군별 체중 부하를 측정하였다. 측정 결과 MIA를 투여하기 3일 전에는 모든 시험 군이 동일한 수준을 보였으나 투여 후 3일이 경과한 0일차에는 대조군을 비롯한 시험군들이 정상군에 비해 모두 유의하게 체중 부하가 감소되어 정상군(Normal)이 47.8±4.2%, 대조군(Control)이 24.4±2.5%, 저농도 투여군(HP-04 50)이 29.6±3.7%, 중농도 투여군(HP-04 100)이 26.9±2.1%, 고농도 투여군(HP-04 200)이 27.7±2.8%로 나타났다. 이처럼 감소된 체중 부하는 7일차까지는 대조군 대비 시험군에서 유의적인 차이를 보이지 않았으나 14일차부터 대조군에 비해 시험군이 점차 호전되는 양상을 보였다. 14일차 각 시험군별 체중 부하는 정상군(Normal)이 48.8±0.4%, 대조군(Control)이 30.9±2.0%, 저농도 투여군(HP-04 50)이 35.6±2.2%, 중농도 투여군(HP-04 100)이 38.6±3.2%, 고농도 투여군(HP-04 200)이 40.7±2.5%로 나타나 대조군과 비교하여 저농도 투여군은 높은 경향을 보였고 중농도 투여군과 고농도 투여군은 모두 유의하게 증가된 것으로 조사되었다. 시험 종료 시점인 21일차의 각 시험군별 체중 부하값은 정상군(Normal)이 53.9±2.2%, 대조군(Control)이 38.2±0.9%, 저농도 투여군(HP-04 50)이 38.9±0.8%, 중농도 투여군(HP-04 100)이 43.6±0.7%, 고농도 투여군(HP-04 200)이 46.1±0.7%로 나타나 14일차와 유사하게 중농도 투여군과 고농도 투여군에서 대조군에 비해 유의하게 증가된 것으로 확인되어 HP-04가 MIA로 유도된 관절염의 개선 효과가 있음을 확인할 수 있었다(Fig. 3B).

Fig. 3. The effect of MIA-induced osteoarthritis on (A) Clin-ical arthritis index and (B) Animal arthritis weight load index. a~c) The statistical significance level of the mean value for each test group is expressed in each subgroup for p<0.05.

혈중 염증성 Cytokine 함량 분석

골 관절염 모델에서 본 연구에 사용한 HP-04가 혈중 cytokine의 함량에 미치는 영향을 살펴보고자 먼저 TNF-α(tumor necrosis factor-α)의 혈중 농도를 분석하였다. 정상군의 경우 1.63±0.31 pg/ml로 대조군의 3.50±0.17 pg/ml과는 유의한 차이를 나타냈고, 저농도 투여군(HP-04 50)은 3.47±0.43 pg/ml로 대조군과 유의한 차이를 보이지 않았으나, 중농도 투여군(HP-04 100)은 2.93±0.52 pg/ml로 대조군보다는 낮은 경향을, 고농도 시험군(HP-04 200)은 29±0.40 pg/ml로 대조군에 비해 유의하게 낮은 것으로 조사되었다(Fig. 4A). 혈중 IL-6(interleukin 6)은 정상군이 63.71±3.30 pg/ml, 대조군이 82.57±3.36 pg/ml, 저농도 투여군(HP-04 50)이 67.76±3.20 pg/ml, 중농도 투여군(HP-04 100)이 70.43±4.19 pg/ml, 고농도 시험군(HP-04 200)이 67.90±1.73 pg/ml으로 나타나 대조군과 비교하여 시료를 투여한 시험군 모두에서 유의하게 감소된 것으로 나타났다(Fig. 4B). 혈중 TIMP-1(Tissue inhibitor of metallo-proteinase-1)은 정상군에서 558.5±27.9 pg/ml으로 대조군의 538.2±9.6 pg/ml에 비해 높게 나타났다. 반면 저농도 투여군(HP-04 50)이 507.4±9.0 pg/ml, 중농도 투여군(HP-04 100)이 512.6±11.3 pg/ml, 고농도 시험군(HP-04 200)이 515.2±18.0 pg/ml로 나타나 시료의 투여 농도가 증가할수록 TIMP-1의 함량이 증가된 것으로 나타났으나 군간 유의한 차이는 보이지 않았다(Fig. 4C). 한편, HP-04가 골 관절염 모델의 혈중 MMP(matrix metalloproteinase)의 농도에 미치는 영향을 확인하고자 혈중 MMP-2의 함량을 분석한 결과는 대조군은 6401.4±548.3 pg/ml로 정상군의 3494.3±330.8 pg/ml에 비해 유의하게 증가된 것으로 나타났다. 반면 저농도 투여군(HP-04 50)은 6029.3±277.2 pg/ml로 대조군에 비해 낮은 경향을 보였고, 중농도 투여군(HP-04 100)과 고농도 시험군(HP-04 200)은 각각 4911.7±145.3 pg/ml, 4167.9±605.8 pg/ml로 나타나 대조군보다 유의하게 낮은 것으로 조사되었다(Fig. 4D). MMP-9의 경우 정상군과 대조군은 각각 9.13±0.35 ng/ml, 11.17±0.12 ng/ml로 유의한 차이를 보였는데, 저농도 투여군(HP-04 50)은 10.75±0.16 ng/ml로 대조군보다 낮은 경향을 보였고 중농도 투여군(HP-04 100)과 고농도 시험군(HP-04 200)은 각각 10.48±0.16 ng/ml, 10.50±0.13 ng/ml로 나타나 대조군에 비해 유의하게 낮은 것으로 조사되었다(Fig. 4E). 시험 결과로 볼 때 HP-04는 MMPs 생성을 억제하여 연골 파괴를 감소시켜 줄 것으로 사료된다. 혈중 PGE2(prostaglandin E2)를 분석한 시험에서 정상군은 1249.79±33.55 pg/ml로 대조군의 1413.29±18.53 pg/ml과는 유의한 차이를 보이는 것으로 나타났다. 저농도 투여군(HP-04 50)은 1425.34±15.99 pg/ml로 대조군과는 유의한 차이를 보이지 않았으나 중농도 투여군(HP-04 100)과 고농도 시험군(HP-04 200)은 각각 1318.26±37.20 pg/ml과 1274.65±18.75 pg/ml로 나타나 대조군에 비해 유의하게 감소되어 정상군과 유사한 수준을 보이는 것으로 조사되었다(Fig. 4F).

Fig. 4. The effect of MIA-induced osteoarthritis on blood cytokines content. A: TNF-, B: IL-6, C: TIMP-1, D: MMP-2, E: MMP-9, F: PGE2. (a~d) The statistical significance level of the mean value for each test group is expressed in each subgroup for p<0.05.

조직학적 분석

HP-04의 골 관절염 동물모델의 관절 조직에 미치는 영향을 알아보기 위하여 H&E 염색을 통해 염증 반응 발생 유무와 활막세포의 증식 여부를 관찰하고, Safranin-O 염색에서 연골의 proteoglycan 층의 변화를 확인하였다. 먼저 H&E 분석에서 정상군의 관절은 활막조직이 규칙적으로 배열되어 있고 염증 세포가 발견되지 않은 양호한 상태로 확인되었다. 반면 대조군은 관절 주변에 심각한 연골 조직의 손실(bone erosion)과 조직 내 염증 세포의 침윤이 현저하게 관찰되었으며, 활막의 염증(synovial inflammation) 비후도 관찰되었다. 반면 HP-04를 투여한 시험군은 투여 농도가 증가할수록 염증 세포의 침윤과 조직 손실이 점차 감소되는 것으로 나타났는데, 특히 고농도 투여군인 200 mg/kg 시험군은 조직 내에 염증 세포의 침윤이 관찰되지 않았으며 조직 배열이 비교적 균일하게 관찰되어 관절염이 양호한 수준으로 회복된 것으로 조사되었다(Fig. 5). Safranin-O 분석에서 정상군은 관절연골의 접촉부위와 이행부위 및 방사부위의 연골세포들이 평행으로 배열되어 있고 연골 기질도 잘 보관되어 있었으나 대조군은 염증성 소견 및 연골의 침습으로 proteoglycan의 소실이 있었으며, 연골밑뼈 조직이 광범위하게 파괴되어 있는 것으로 관찰되었다. 반면 HP-04 투여군의 경우 저농도 투여군에서 연하게 확인되는 연골층이 중농도 투여군에서 선명하게 확인되고, 고농도 투여군에서는 정상군과 유사한 수준으로 회복되어 대조군에 비해 연골층이 많이 호전된 것으로 확인되었다(Fig. 6).

Fig. 5. Effects of MIA-induced osteoarthritis on animal joints.A, a: Normal, B, b: Control, C,c: Low group(50 mg/kg), D, d: Mid. group(100 mg/kg), E,e: High group(200 mg/kg). Hema-toxylin & Eosin staining (×40 & ×100). Scale bar = 100 μm

Fig. 6. Effects of MIA-induced osteoarthritis on animal joints. A, a: Normal, B, b: Control, C, c: Low group(50 mg/kg), D, d: Mid. group(100 mg/kg), E,e: High group(200 mg/kg). Safr-anin-O staining (×40 & ×100). Scale bar = 100 μm

Micro-CT 분석

MIA 단독 투여군과 시료 투여군의 무릎 관절의 연골 양을 micro-CT를 이용하여 분석한 결과 정상군에 비해 대조군의 연골이 감소되었으나 HP-04를 투여한 시험군에서 증가하는 양상을 보여 중농도 투여군인 100 mg/kg 시험군과 고농도 투여군인(200 mg/kg) 시험군은 정상군과 유사한 수준의 연골 양을 나타내었다(Fig. 7, Table IV). 결과적으로 본 천연 기능성 복합 처방의 투여는 MIA에 의해 유발된 경골 골단의 여러 지표의 변화를 억제해 주는 것으로 사료된다.

Fig. 7. Effects of MIA-induced osteoarthritis on animal joints(Mirco-CT). A: Normal, B: Control, C: Low group(50 mg/kg) D: Mid. group(100 mg/kg) E: High group(200 mg/kg)

Table IV. Effect of treatment with samples on cartilage volume​​​​​​​

결론

본 연구는 해동피추출물 등 복합물(HP-04)이 골 관절염 동물 모델에서 골 관절염 유발 인자에 미치는 영향을 조사하고자 실시하였다. MIA를 주사하여 골 관절염을 유발시킨 후 HP-04를 경구 투여 하고 혈액 및 관절, 조직 등을 이용하여 골 관절염 유발 인자들을 확인하였다. 시험 결과는 저농도, 중농도, 고농도의 세 가지 다른 군으로 분류하여 주간 체중변화량, 식이섭취량 및 음수 섭취량등을 측정하였으며, TNF-α(tumor necrosis factor-α), IL-6(interleukin 6), TIMP-1(tissue inhibitor of metalloprotease-1), MMP-2(matrix metalloprotease-2), MMP-9(matrix metalloprotease-2) 등의 혈액 분석과 조직학적 검사, micro-CT 등의 분석을 통하여 다음과 같은 결론을 얻었다. HP-04는 MIA에 의해 유도된 퇴행성 골 관절염 동물모델에서 관절염 임상 지수와 체중 부하를 유의적으로 개선시켰으며, 염증을 촉진시키는 염증성 cytokine인 TNF-α와 IL-6 생성량은 유의성 있게 감소하였다. 또한 교원질 및 단백다당과 같은 세포외기질 성분을 분해하는 MMPs 생성량 및 염증반응과 MMPs의 생성 유도를 통한 조직 파괴를 유도하는 PGE2의 생성량을 유의성 있게 감소시켰다. 이러한 결과는 micro-CT 및 조직 염색결과 염증세포의 침윤, 관절 조직의 변형, 조직의 손상, 연골 파괴 등이 대조군 대비 감소시킨 결과와 일치한다. 이러한 결과로 볼 때, HP-04는 골관절염 유발 인자를 억제하여 염증을 억제하고 관절 및 연골 파괴를 억제함을 제시하고 있다. 이와 같은 결과는 HP-04가 골 관절염에 대한 예방과 개선 효과를 나타내는 건강기능식품 또는 의약품으로 활용될 수 있을 것이라 사료된다.