Rhynchosia volubilis Lour. and Beta vulgaris Modulate Extracts Regulate UV-Induced Retinal Pigment Epithelial Cell and Eye Damage in Mice

약콩, 비트 추출물의 자외선에 의한 망막 상피세포와 마우스의 눈 손상 조절 효능

Abstract

Ultraviolet (UV)-induced damage plays a major role in ocular diseases, such as cataracts and retinal degeneration. UV irradiation can generate free radicals including reactive oxygen species (ROS), which are known to cause lipid peroxidation of cellular membranes. It has also been shown that UV can damage DNA directly and induce apoptosis. Rhynchosia volubilis Loureiro (the small black bean or yak-kong, RV) and Beta bulgaris (beet, BB) are used as health supplements. In this study, we explored the protective effects of RV and BB against UVA-induced damage in human pigment epithelial (ARPE-19) cells and in mice. RV and BB mixture and their effective constituents (cyanidin, delphidin, petunidin glycosides) improved cell viability and suppressed intracelluar ROS generation. Phosphorylation of p38 mitogen-activated protein kinase (MAPK), c-Jun N-terminal kinase (JNK), Erk1/2 was analyzed by immunoblotting. RV and BB mixture inhibited UVA-induced phosphorylation of p38 MAPK, JNK, Erk1/2 in APRE-19 cells. RV and BB treatment also showed protective effects on ocular damage in UVA-irradiated mice by increasing the levels of endogenous antioxidants such as superoxide dismutase and glutathione. RV and BB have the potential to be used in a range of ocular diseases and conditions, based on in vitro and in vivo study.

소득수준의 향상과 의료기술 발달에 따른 고령 인구의 증가로 노인성, 만성 질환 유병율이 증가하고 있다.¹⁾ 생활을 통해 얻을 수 있는 정보의 약 80%는 눈으로부터 얻을 수 있을 정도로 눈은 가장 중요한 감각기관이다. 따라서 눈의 기능적 장애 또는 상실은 생활의 질을 떨어뜨리는 가장 큰 요인의 하나가 된다. 현대인은 컴퓨터와 인터넷 보급 등에 의하여 VDT 증후군(visual display terminal syndrome) 등의 질환을 겪고 있고, 노화 또는 갱년기현상, 자가 면역질환, 갑상선 질환 또는 각막의 예민성 감소 등의 요인에 의하여 시력이 저하되고 있으며, 안구 건조증, 각막염, 백내장, 황반변성 등의 안질환이 많이 발생되고 있다.²⁾

특히, 활성산소(reactive oxygen species, ROS) 등에 의한 산화적 스트레스(oxidative stress)는 눈 손상을 유발시킬 수 있으며, 고령자일수록 ROS 등의 산화적 스트레스에 대한 방어력이 감소하기 때문에 안질환 유발 가능성이 높아진다. 최근에는 30~40대에서도 다양한 원인에 의해 발생률이 증가하고 있는 추세이다.^3,4) 주요한 발생원인은 산화적 스트레스, 단백질 응집 등 다양하지만 눈 조직의 GSH(glutathione), SOD(superoxide dismutase) 등이 감소되어 산화적 스트레스에 대한 방호능력이 저하되기 때문에 유발되는 것으로 보고되었다^4,5). 환경오염에 따라 대기 중에 증가한 자외선은 물론 스마트기기로부터 유발되는 블루라이트 등은 눈 조직내 ROS 생성과 세포 손상을 유발한다.^6,7)

Mitogen-activated protein kinases는 세포 신호 전달에 주요한 요소로 알려져 있으며 인산화를 통해 표적 전사 인자의 활성을 조절한다. MAPK는 ERK1/2(extracellular regulated kinase 1/2), p38 kinase, JNK(c-Jun N-terminal kinases)가 주요한 인자로 알려져 있으며, 이들은 자외선 조사, 산화적 스트레스, cytokines (IL-1β, TNF-α)등에 의해 활성화된다. 활성화된 MAPK는 세포 사멸, 성장, 면역 기능 조절에 관여한다.^8,9)

망막 색소 상피 세포(retinal pigment epithelial, RPE cells)는 신경 망막 기능을 유지에 중요한 세포이다. ROS는 망막 색소 상피 세포를 포함한 눈 조직 내 세포의 사멸을 유도하는 것으로 보고되었다.⁹⁾ 산화적 스트레스가 세포 사멸을 유도하는 기전은 명확히 규명되진 않았지만 MAPK가 자외선을 포함한 다양한 원인에 의한 망막 색소 상피 세포사멸에 관여하는 것으로 밝혀졌다.^8,9) 그러므로 ROS 생성 억제를 통해 산화적 스트레스에 의한 눈 손상 및 다양한 질병의 예방과 지연을 유도할 수 있을 것으로 예상할 수 있다. 이러한 측면에서 현재까지 산화적 스트레스에 의한 ROS 생성을 억제하기 위한 항산화제 및 천연 소재 개발에 관한 다양한 연구가 보고되었다.^9-11)

콩은 우리나라에서도 주요한 식량으로 뿐만 아니라 민간 요법 및 한약재로 사용한 기록들이 있어 일찍부터 콩의 생리활성 기능에 주목하고 있었음을 알 수 있으며, 특히 예로 부터 검정콩은 소위 ‘약콩’(서목태, 쥐눈이콩, Rhynchosia volubilis Loureiro, RV)으로 불리며 민간요법에 많이 활용되 었다. 약콩 종피에 존재하는 안토시아닌 주성분은 cyanidin-3-glucoside(C3G), delphinidin-3-glucodise(D3G), 그리고 petunidin-3-glucoside(P3G)이며, 안토시아닌 색소 중 C3G는 항산화력이 높고 뇌혈관, 심장질환의 예방과 치료에 대한 효능이 보고되었다.^12,13) 또한, Paik 등은 약콩 종피에서 추출한 안토시아닌이 N-methyl-N-nitrosourea로 유도된 눈 손상을 감소시킨다고 보고하였다.¹⁴⁾ 비트(Beta bulgaris, BB) 는 항산화, 항암, 항염 등 만성질병 예방에 효과적인 것으로 알려져 있으며, 주요 기능 성분은 betalain과 비타민 A, E, 칼륨이다.¹⁵⁾

본 연구에서는 약콩, 비트 추출물과 추출 혼합물의 항산화 활성과 자외선에 의해 유도된 인간 망막 색소 상피 세포 손상 및 마우스 눈 손상 모델에서 효능을 평가하고 관련 기전을 분석하였다.

재료 및 방법

실험재료

본 실험에 사용된 약콩(Rhynchosia volubilis Loureiro,)과 비트(Beta bulgaris) 원료는 국내산으로 전주농업협동조합에서 구입하여 우석대학교 한의과대학 김홍준 교수에 의해 시료를 검증하였다. 증거표본(JAMI-2018A, B)은 (재)전주농생명소재연구원 의약소재산업화팀에서 보관중이다. 분말화한 원료 50 g에 40% 수용성 에탄올(EtOH, pH 1.0)을 3배수 첨가 후 4^oC에서 12시간 동안 추출하였다. 여과한 뒤 감압 농축 후 동결 건조하여 6.31 g(12.61%)과 4.76 g(9.51%)의 약콩과 비트 추출물을 얻었다. 세포 및 동물실험을 위해 추출물은 –80^oC에 보관하였다.

항산화 효능

ABTS(2, 2'-azinobis-(3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid, Sigma-Aldirch Co., St. Louis, MO, USA) 라디칼 소거활성은 Re¹⁶⁾등의 방법을 변형하여 측정하였다. 시료액 10 μL에 ABTS solution을 90 μL을 혼합하여 37^oC 에서 30분 동안 암소에서 반응시킨 후 Multiskan ELISA (Thermo scientific, USA)로 734 nm에서 흡광도를 측정하였다. 시료 첨가구와 무첨가구를 양성대조군과 비교하여 라디칼 소거능을 백분율(%)로 나타내었다. 양성대조군으로는 Trolox(Sigma-Aldrich)를 사용하였다. DPPH(2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl) 라디칼 소거능은 Blois¹⁷⁾의 방법을 변형하여 측정하였다. 시료액 20 μL과 DPPH 용액 80 μL를 혼합 하여 암소에서 30분간 반응시킨 후 Multiskan ELISA (Thermo scientific)로 517 nm에서 측정하였다. 시료 첨가구와 무첨가구를 양성대조군과 비교하여 라디칼 소거능을 백분율(%)로 나타내었다. 양성대조군으로는 L-Ascorbic acid 를 사용하였다. SOD(Superoxide dismutase) 유사활성은 SOD assay kit(Sigma-Aldrich)를 사용하여 측정하였다.

세포배양 및 자외선 조사

인간 망막 상피 세포(ARPE-19 cells, American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA)은 10% FBS(fetal bovine serum, Gibco, Invitrogen Co., NY, USA), 100 μg/mL penicillin, 100 μg/mL streptomycin (Gibco)가 포함된 DMEM/F12(Gibco) 배지에서 37^oC, 5% CO₂ 조건으로 배양하였다. ARPE-19 세포는 자외선 조사기 (CL-1000M, UVP, Analytik Jena, Germany)로 자외선 (365 nm, 0.12 J/cm2)을 2분간 조사하여 손상을 유발하였고, 세포 독성은 MTS와 LDH assay kit(Promega, Madison, USA)를 사용하여 측정하였다. 세포독성 분석을 통해 약콩과 비트 추출물, 약콩 및 비트 추출 혼합물의 자외선에 의한 세포 손상 보호효과는 자외선만 조사한 군의 생존율을 100%로 환산하여 비교하였다.

추출물의 주요성분 분석

추출물의 주요성분은 LCMSD( High Performance Liquid Chromatography-Mass Selective Detector, Agilent 1100 LC/MSD Model G1946D) 를 사용하여 분석하였다. HPLC 분석 조건은 Eclipse C18(4.6×150 mm, 3.5 μm) column을 사용하였고, A: 5% formic acid(aq.)와 B: 5% formic acid(MeOH)를 이동상으로 선정하고 gradient 조건: 5% B, 1 min → 40% B, 29 min → 100% B 10min으로 분석하였다.

세포내 활성산소 및 사멸 분석

자외선 조사에 의한 세포내 활성산소와 세포사멸을 분석하기 위해 DCF-DA(2, 7'- dichlorofluorescein diacetate, Sigma-Aldrich)와 Hoechst 33342(Thermo Fisher Scientific, Waltham, Ma, USA)를 이용하여 세포를 염색한 후 형광이미지를 분석하였다. ARPE-19 세포를 1×10⁵ cells/mL로 분주하여 24시간 배양하였다. 100 μg/mL의 약콩 추출물, 약콩 및 비트의 추출 혼합물, 10 μM의 C3G(cyanidin-3-glucoside), D3G(delphinidin-3-glucoside), P3G(petunidin-3-glucoside)을 1시간 동안 전 처리한 후 자외선을 2분간 조사하고, 24시간 동안 5% CO2 배양기에서 배양하였으며, 그 후 형광현미경(Nikon, Japan)을 사용하여 분석하였다. 대조구는 추출물 대신 DMSO(dimethyl sulfoxide)를 처리하였다.

Western Blot에 의한 단백질 발현의 분석

추출물과 자외선을 처리하고 24시간 후 세포를 수집하여 2-3회 PBS로 세척한 후 100 μL의 ice-cold RIPA buffer(10 mM Tris-HCl, pH 7.5, 0.1% NP-40, 0.5% sodium deoxycholate, 0.1% SDS, 1 mM sodium orthovandate, 120mM sodium chloride, 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride, 10 μg/mL leupeptin, 1 μg/mL aprotinin)을 첨가하여 30분간 lysis시킨 후 12,000 rpm에서 10분간 원심분리하여 세포막 성분 등을 제거하였다. 단백질 농도는 BSA(bovine serum albumin)를 표준화하여 BCA Protein Assay Kit(Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 정량하였다. 50 μg의 lysate를 8-12% SDS-PAGE로 분리하여, 이를 PVDF membrane(Bio-Rad Lab., Hercules, CA, USA)에 transfer하였다. 항체와 단백질 간의 비 특이적인 결합을 차단하기 위하여 blocking buffer(2.5% skim milk in TBST)에서 실온 1시간 동안 교반하였다. Blocking시킨 membrane은 일차 항체(anti-phospho-p38, anti-p38, antiphospho- JNK, anti-JNK, anti-phospho-ERK1/2, anti-ERK1/2, anti-GADD45, anti-cPARP, anti-β-actin, SantaCruz Biotechnology, Inc. USA)를 TBST 용액에서 희석하여 4^oC 에서 overnight(anti-β-actin은 1:5,000, 그리고 그 외 다른 항체는 1 : 2,500으로 blocking buffer에 희석) 반응시킨 후, 이차항체(anti-mouse IgG or anti-rabbit IgG linked with horseradish peroxidase, SantaCruz Biotechnology)를 실온에서 2시간 동안 반응하였다. 그리고 enhanced chemiluminescence (ECL) 용액과 반응시킨 후 Gel Documentation chemiluminescent imaging system(Amersham imager 600, GE Healthcare, Buckinghamshire, UK)으로 단백질 발현을 확인 하였다.

실험동물의 사육 및 자외선에 의한 눈 손상 유도

자외선에 의한 눈 손상 동물 모델에서 시료의 효능을 분석하기 위해 C57BL/6J 수컷 마우스(7주령, 18~20 g, 다물사이언스, Daejeon, South Korea)를 사용하였다. 1주간 사육환경에 적응시킨 후, 6마리씩 3군으로 분류하였다. 대조군(Control)과 6시간 동안 자외선을 조사한 대조군(UVA), 약콩과 비트 추출물(9 : 1)을 10% 첨가한 식이를 7주일간 급이한 후 자외선을 조사한 시험군으로 구성하였다. 실험동물의 사육환경은 온도 25 ± 2^oC, 상대습도 55 ± 5%로 유지시켰고, 명암은 12시간 주기로 자동조절 하였다. 식이와 식수는 자유롭게 섭취하도록(ad libitum)하였다. 본 실험은 (재)전주농생명소재연구원 동물실험윤리위원회의 승인(JAMI IACUC2016003)을 받아 진행하였다.

안구 형태 및 조직내 SOD, GSH 분석

자외선 조사 6시간 후 안구 형태의 변화는 현미경 카메라(Loistics, China) 로 관찰하였고, 적출한 안구 조직은 ice-cold RIPA buffer로 lysis하여 SOD 및 GSH assay kit(Sigma-Adrich)를 사용하여 측정하였다.

통계처리

상기의 모든 실험 결과는 3회 이상 반복 실험하였으며, 모든 실험값은 평균 ± 표준편차로 나타내었다. 통계적 분석은 SigmaPlot program(v10. San Jose, CA, USA) 를 이용하였고, 유의성 검정은 ANOVA(one-way analysis of variance) 및 Student’s t-test를 이용하여 p< 0.05 수준에서 검증하였다.

결과 및 고찰

약콩과 비트 추출물과 혼합물의 배합비에 따른 항산화능 분석

본 연구에서는 항산화 효능이 우수한 것으로 알려진 약콩과 비트 추출물, 혼합물의 항산화 활성과 자외선에 의한 눈 손상 모델에서의 효능을 비교 분석하기 위해 배합비에 따른 항산화능을 분석하고, 최적 배합비를 선정하고자 하였다. 약콩과 비트는 항산화 활성이 우수한 안토시아닌 함량을 높이기 위해 40% 수용성 EtOH(pH 1 .0)를 사용하여 4^oC에서 12시간 동안 추출하였다.

항산화 활성을 측정하는 방법으로 ABTS, DPPH, SOD activity를 이용하였다. ABTS는 짙은 청록색을 띄며 항산화물질과 반응하면 투명색으로 탈색이 된다. DPPH 라디칼소거능은 안정적인 자유 라디칼로서 2, 2-diphenyl-picrylhydrazyl(DPPH)가 보통 517 nm 파장에서 흡수가 일어나 보랏빛을 띄게 되나 항산화 물질과 반응하게 되면 구조가 바뀌어 노란빛을 띄게 된다. SOD(superoxide dismutase) 유사 활성은 생체 내에서 ROS 소거에 관여하는 효소이다.¹⁸⁾ 약콩과 비트 추출물과 배합비에 따라 혼합한 후 항산화 활성을 분석하였다(Fig. 1). ABTS, DPPH 라디칼 소거능은 약콩 추출물 단독이 가장 우수한 효능을 보였고, SOD 유사활성은 약콩 추출물의 함량이 10% 이하에서 낮은 결과를 보였다(Fig. 1). DPPH 라디칼 소거능은 약콩 추출물의 함량 90% 이하에서부터 급격히 감소하는 것으로 분석되었다. 이러한 결과로 보아 약콩 종피 함량이 90% 이상 혼합한 추출물이 항산화능이 우수한 것으로 예측할 수 있다.

Fig. 1. Antioxidant effects of Rhynchosia volubilis (the small black bean, RV) and Beta bularis (Beet, BB) dependent on their combination ratio. SOD, Superoxide Dismutase; ABTS, DPPH radical scavenging activity.

약콩과 비트 추출물과 혼합물의 자외선에 의한 ARPE-19 세포 보호능 분석

망막 색소 상피 세포는 광 수용체와 혈관맥락막 사이에 있는 단일 세포층으로 과도한 빛이 망막에 도달하는 것으로 조절하고, 세포 분화와 망막의 광 수용체를 보호 및 면역을 제어한다.¹⁹⁾ 하지만 노화와 산화 스트레스에 의해 염증 및 세포의 기능이 저하된다.^6-8,20) 이러한 배경에서 약콩과 비트 추출 혼합물의 자외선을 처리에 의한 ARPE-19 세포 손상에 대한 효능을 비교한 결과 각 혼합물과 추출물을 단일농도(100 μg/mL)로 1시간 동안 전처리하고, 자외선(365 nm)을 2분간 조사한 후 24시간 동안 37^oC에서 반응시킨 후 세포독성을 분석하였다. 결과는 Fig. 2에서 나타낸 바와 같으며 약콩 추출물과 약콩과 비트 추출물을 9 : 1로 혼합하였을 때 보호능이 가장 우수하였다. 항산화능과 자외선에 의한 ARPE-19 세포 보호능에 대한 결과를 종합하여 세포와 동물수준에서 자외선에 의한 손상 모델에서의 효능은 약콩 단독 추출물과 약콩 추출물과 비트 추출물을 9 : 1로 혼합하여 분석하였다.

Fig. 2. Preventive effects of RV, BB, and their combination against UVA damage in human retinal epithelial cells (ARPE-19). The effects were decreased following the BB ratio increase. Data are means ± SE of at least three independent experiments. *p<0.01 versus B. B, Blank.

약콩 추출물과 비트 혼합물의 자외선에 의한 세포내 ROS 생성 억제 효과

ARPE-19 세포에 자외선을 조사에 의한 세포내 ROS 생성은 DCF-DA(2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate)를 사용하여 분석하였고, 약콩 추출물과 비트 혼합물(9:1), 안토시아닌의 주요성분인 D3G, C3G, P3G를 양성대조군으로 활용하여 세포 내 ROS 생성에 미치는 영향을 비교하였다. 약콩 추출물과 비트 혼합물(9:1)의 주요성분은 LC-MSD를 통해 분석한 결과 D3G, C3G, P3G가 주요성분으로 확인되어 유효성 평가의 양성대조군으로 선정하였다 (Fig. 3A). Fig. 3B.에 제시한 바와 같이 자외선(365 nm) 조사는 ARPE-19 세포 내 ROS 생성을 증가시켰고, 약콩 추출물과 비트 추출물을 9:1로 혼합하여 전처리한 후 자외선을 조사하였을 때 세포 내 ROS 생성이 억제되는 것을 확인하였다. 추출물의 주요성분으로 양성대조군인 D3G, C3G, P3G에 의해서도 세포 내 ROS 생성이 억제되었다(Fig. 3B).

Fig. 3. RV or RV/BB mixture and their main anthocyanins inhibited intracellular H₂O₂ production in ARPE-19 cells. A. Representative HPLC chromatogram and MS spectrum of RV or RV/BB mixture. B. UVA stimulated intracellular reactive oxygen species (ROS, H₂O₂) increase which were prevented by RV, RV/BB (9:1 mixture), C3G, D3G, and P3G treatment.

약콩 추출물과 비트 혼합물의 세포 손상 억제 기전 분석

MAPK는 여러 외부 자극에 의해 세포의 성장, 사멸, 분화 등에 관여하는 신호전달 기전인자로서 p38, JNK, ERK kinase로 구성되어 있으며, 전사조절인자들을 인산화함으로 다양한 유전자들의 발현을 조절한다.^8,9) 이들 MAPK는 ROS 를 포함한 물리적, 화학적 스트레스 인자에 의해 활성화되어 세포사멸 및 독성을 증가시키는 것으로 알려져 있다.⁸⁾

이러한 배경으로 약콩 추출물과 비트 추출물은 혼합한 시료의 처리가 자외선에 의한 ROS 생성 및 ARPE-19 세포 손상 억제를 유도하는 기전으로 MAPK를 분석하였다. Western blot 분석결과 MAPK 인자들인 p38, JNK, ERK1/2의 인산화가 ARPE-19 세포에서 자외선에 의해 증가되었고, 약콩 종피와 비트 추출 혼합물 및 양성대조군인 안토시아닌 주요성분에 의해 억제되는 것을 확인하였다(Fig. 4). 양성대조군인 D3G, C3G, P3G에 의해서도 유사한 효능이 확인되었다. 이러한 결과로 미루어 약콩 추출물과 비트 추출물을 혼합 처리는 세포 내 ROS 생성을 억제하고, MAPK의 인산화를 억제하여 자외선에 의한 세포 손상을 억제하는 것으로 추측할 수 있다.

Fig. 4. RV or RV/BB mixture and their main anthocyanins inhibited mitogen-activated kinases (MAPK) in ARPE-19 cells. ARPE-19 cells were pretreated with indicated compounds for 1 h, stimulated by UVA for 2 min and further incubated for 24 h. The MAPKs phosphorylation was detected using immunoblot.

약콩 추출물과 비트 혼합물의 세포 사멸 억제 효능 분석

자외선은 ARPE-19 세포의 사멸을 유도한다. 자외선에 의해 세포 내 항산화능의 불균형은 caspase 3 및 PARP의 분해를 통해 세포사멸을 유도하며^,7,8) 미코콘드리아, 리소좀 및 프로테아좀을 포함한 다양한 경로에 의한 GADD45 또한 세포사멸을 유도하는 것으로 밝혀졌다.^21,22) Tong²²⁾ 등은 자외선 조사에 의해 MAPK가 GADD45 활성화에 기여하는 것으로 보고하였다. 자외선 조사는 ARPE-19 세포의 핵의 수축과 GAAD45 및 cPARP의 cleavage를 유도하였다 (Fig. 5). 반면, 약콩 추출물과 비트 추출물을 혼합물을 전처리한 그룹에서는 세포핵의 수축과 GADD45, cPARP의 단백질 수준에서 과발현 및 cleavage를 억제하는 것으로 확인되었다. 양성대조군인 D3G, C3G, P3G 또한 세포 사멸을 억제하였다. 이러한 결과로 약콩 추출물과 비트 추출물을 혼합한 시료가 자외선에 의한 산화적 스트레스로 유발된 세포사멸을 억제하는 것으로 해석할 수 있다.

Fig. 5. UVA irradiation-induced apoptosis were prevented by RV/BB and anthocyanins in ARPE-19 cells. A. Apoptotic cells were detected as a condensed nuclear chromatin when visualized with Hoechst 33342, which were reserved by indicated compounds. B. RV/BB as well as their active compounds abolished GADD45 and cPARP protein overexpression in ARPE-19 cells.

약콩 및 비트 추출물의 혼합 투여가 자외선에 의한 마우스 눈 손상 억제 효능 분석

약콩 추출물 단독 처리와 약콩 추출물과 비트 추출물을 9:1로 혼합한 시료군에서 자외선에 의한 ARPE-19세포의 활성 산소 생성억제 및 세포사멸을 유사하게 억제하는 결과를 토대로 자외선으로 마우스 눈 손상 모델에 대한 효능 평가를 위해 약콩 추출물과 비트 추출물을 9:1로 혼합한 시료를 사용하였다. 자외선 조사전 7일간 10%의 시료를 포함한 식이를 급이하였으며, 대조군과 자외선 조사군은 정상식이를 공급하였다. 7일 이후 6시간 동안 UV crosslinker에서 자외선(365 nm)을 6시간 동안 조사하고, 6시간 경과 후 마취하여 현미경 카메라를 사용하여 눈의 형태를 비교한 결과 자외선을 조사한 군의 각막 혼탁이 진행됐지만, 시료를 포함한 식이를 7일간 공급한 시험군은 정상 대조군과 혼탁이 두드러지지 않았다(Fig. 6A). 안구 조직내 산화적 스트레스를 조절하는 SOD와 GSH의 수준을 비교한 결과, 자외선을 조사한 군은 정상 대조군과 비교하여 유의하게 감소한 것으로 분석되었고, 시료를 투여한 군의 눈 조직 내 SOD 및 GSH 수준은 자외선을 조사한 군에 비해 유의하게 높은 것으로 확인되었다(Fig. 6B). 이러한 결과는 약콩과 비트 추출물의 혼합물이 눈 조직의 산화 스트레스에 의한 항산화능을 조절하여 자외선에 이한 각막 손상을 억제하는 것을 시사하는 것이다.

Fig. 6. RV/BB mixture prevented ocular damage in UVA irradiation-induced ocular injury. A. Representative lens phenotype after UVA irradiation for 6 h. Endogenous antioxidant enzymes, B. SOD and C. Total glutathione, were decreased by UVA irradiation. The RV/BB prevented their inactivation. Data are means ± SE of at least three independent experiments. **p<0.01 versus Control, ^### p<0.001 versus UVA treatment.

결론

본 연구에서는 약콩 및 비트 추출물과 각 추출물을 혼합 하여 항산화능이 우수한 추출물과 배합비를 선정하였고 약콩 추출물 단독 처리와 약콩 추출물에 비트 추출물을 10% 혼합한 시료를 활용하여 자외선에 의한 망막 색소 상피 세포 손상과 마우스 눈 손상 모델에서 효능을 분석하였다. 세포 수준에서 약콩 추출물과 비트 추출물을 혼합한 군은 세포내 ROS 생성, MAPK(p38, JNK, ERK1/2)의 인산화와 세포 사멸을 억제하는 것으로 확인되었다. 동물수준에서의 효능은 약콩 추출물과 비트 추출물 혼합물을 첨가한 식이를 공급하고 자외선을 6시간 동안 조사하여 급성 각막 손상 모델을 통해 평가하였고, 시료를 공급한 시험군에서는 자외선 조사군에 비해 각막 손상 예방 효과와 조직 내 SOD, GSH 수준이 감소하는 것을 확인하였다. 이러한 결과를 종합하면, 약콩 추출물과 비트 추출물, 이들의 혼합물은 자외선에 의한 ROS 생성을 억제하고 산화스트레스에 의한 방어 시스템을 보호하여 자외선에 의한 눈 손상을 유도하는 MAPK 기전을 제어하여 세포 사멸과 각막 손상을 예방하는 것으로 해석할 수 있다(Fig. 7). 본 연구결과는 약콩과 비트 등 항산화 활성이 우수한 소재가 자외선 등 산화적 스트레스로 유도된 눈 손상의 예방과 치료제 및 기능성 식품 소재로 활용 가능할 것으로 사료된다.

Fig. 7. Signaling pathways of RV/BB preventive effect on UVA-irradiated retinal injury.