• KSBB Journal
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• 제31권4호
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• pp.277-283
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• 2016

In this system, rice cells were genetically modified to express human cytotoxic T-lymphocyte antigen 4-immunoglobulin (hCTLA4Ig) using RAmy3D promoter induced by sugar depletion. Even though the target protein fused with signal sequence peptide, plant cell wall can be a barrier against secretion of recombinant proteins. Therefore, hCTLA4Ig can be trapped inside cell wall or remained in intracellular space. In this study, to enhance the secretion of hCTLA4Ig from cytoplasm and cell walls into the medium, permeabilizing agents, such as dimethyl sulfoxide (DMSO), Triton X-100 and Tween 20, were applied in transgenic rice cell cultures. When 0.5% (v/v) of DMSO was added in sugar-free medium, intracellullar hCTLA4Ig was increased, on the other hand, the secreted extracellular hCTLA4Ig was lower than that of control. DMSO did not give permeable effects on transgenic rice cell cultures. And Triton X-100 was toxic to rice cells and also did not give enhancing permeability of cells. When 0.05% (v/v) Tween 20 was added in rice cell cultures, however, intracellular hCTLA4Ig was lower than that of control cultures. And the maximum 44.76 mg/L hCTLA4Ig was produced for 10 days after induction, which was 1.4-fold increase compared to that of control cultures. Especially, Tween 20 at 0.05% (v/v) showed the positive effect on the secretion of hCTLA4Ig though the decrease of intracellular hCTLA4Ig. Also, Tween 20 as a non-toxic surfactant did not affect the cell growth, cell viability and protease activity. In conclusion, secretion of hCTLA4Ig could be increased by enhancing permeability of cells regardless of the cell growth, cell viability and protease activity.

• 식물조직배양학회지
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• 제25권3호
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• pp.147-152
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• 1998

AL1-gene은 TGMV의 복제에 매우 중요한 역할을 하고 있다. 이 AL1 gene의 발현을 억제하기 위해서는 식물체내에서 AL1 gene의 antisense RNA의 발현에 의한 억제가 효과적 방법 중에 하나로 알려져 있다. 이런 발현을 식물체내에서 실현시키기 위해 hygromycin 저항성 유전자에 antisense AL1-gene을 연결시키고, 연결된 부위를 CaMV35s-promoter와 octopine synthase gene terminator 사이에 연결시켰다. 이 유전자 발현 단위 부분을 다시 kanamycin 저항성 유전자 발현 단위 부분을 지니고 있는 형질 전환 벡터인 pBinAR에 삽입시켜 새로운 형질 전환 벡터인 pAR35-2를 개발하였다. 이 벡터를 Agrobacterium tumefaciens LBA4404에 형질전환 시킨 다음, 토마토와 담배 잎사귀 조직에 감염시켜 식물체들을 kanamycin과 hygromycin이 함유된 배지위에서 배양하여 형질전환된 식물체들을 선발하였다. 형질 전환된 식물체들로부터 antisense AL1-gene 및 antisense RNA를 각각 PCR 및 RT-PCR를 이용한 southern hybridization 방법을 이용하여 증명하였고, 토마토 식물체의 공변세포쌍 내에 있는 엽록체 숫자가 여덟 개라는 것이 확인되어 형질 전환된 토마토 식물체가 2 배수체로서 정상적인 식물체라는 것을 증명하였다. 이러한 형질 전환 식물체는 앞으로 항 바이러스성 형질을 지니는 식물체들을 개발하는 데 많은 도움을 주리라 여겨 진다. 그리고, 본 연구에서 제조된 벡터 pAR35-2는 두 개의 항생제에서 동시 선발 할 수 있도록 되어 있고 promoter가 두 개로 되어 있어 형질 전환 식물체선발 및 유전자 발현 연구에 효과적으로 이용되어 질 수 있으리 라 여겨진다.

• 식물조직배양학회지
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• 제21권5호
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• pp.253-275
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• 1994

Many flowering plants possess genetically controlled self -incompatibility (SI) system that prevents inbreeding and promotes outcrosses. SI is usually controlled by a single, multiallelic S-locus. In gametophytically controlled system, SI results when the S-allele of the pollen is matched by one of the two S-alleles in the style, while in the sporophytic system self-incompatible reaction occurs by the interaction between the pistil genotype and genotype of, not the pollen, but the pollen parent In the former system the self-incompatible phenotype of pollen is determined by the haploid genome of the pollen itself but in the latter the pollen phenotype is governed by the genotype of the pollen parent along with the occurrence of either to-dominant or dominant/recessive allelic interactions. In the sporophytic type the inhibition reaction occurs within minutes following pollen-stigma contact, the incompatible pollen grains usually failing to germinate, whereas in gametophytic system pollen tube inhibition takes place during growth in the transmitting tissue of the style. Recognition and rejection of self pollen are the result of interaction between the S-locus protein in the pistil and the pollen protein. In the gametophytic SI the S-associated glycoprotein which is similar to the fungal ribonuclease in structure and function are localized at the intercellular matrix in the transmitting tissue of the style, with the highest concentration in the collar of the stigma, while in the sporophytic SI deposit of abundant S-locus specific glycoprotein (SLSG).is detected in the cell wall of stigmatic papillae of the open flowers. In the gametophytic system S-gene is expressed mostly at the stigmatic collar the upper third of the style length and in the pollen after meiosis. On the other hand, in the sporophytic SI S-glycoprotein gene is expressed in the papillar cells of the stigma as well as in e sporophytic tape is cells of anther wall. Recognition and rejection of self pollen in the gametophytic type is the reaction between the ribonuclease in the transmitting tissue of the style and the protein in the cytoplasm of pollen tube, whereas in the sporophytic system the inhibition of selfed pollen is caused by the interaction between the Sycoprotein in the wall of stigmatic papillar cell and the tapetum-origin protein deposited on the outer wall of the pollen grain. The claim that the S-allele-associated proteins are involved in recognition and rejection of self pollen has been made merely based on indirect evidence. Recently it has been verified that inhibition of synthesis of S$_3$ protein in Petunia inflata plants of S$_2$S$_3$ genotype by the antisense S$_3$ gene resulted in failure of the transgenic plant to reject S$_3$ pollen and that expression of the transgenic encoding S$_3$ protein in the S$_1$S$_2$ genotype confers on the transgenic plant the ability to reject S$_3$ pollen. These finding Provide direct evidence that S-proteins control the s elf-incompatibility behavior of the pistil.

• 한국육종학회지
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• 제41권3호
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• pp.252-260
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• 2009

1. 본 연구에서는 공동배양 배지에 Agrobacterium 성장 억제물질인 silver nitrate를 첨가하고 변온과 여과지처리를 추가하여 공동배양 기간을 7일로 늘였으며, 또한 항산화 물질 3종을 공동배양 배지에 첨가하여 세포의 oxidative burst를 최소화함으로써 벼 형질전환효율을 높일 수 있었다. 또한 이 방법을 적용하여 형질전환이 어려운 품종을 대상으로도 형질전환 식물체를 작성할 수 있었다. 2. 벼 형질전환체의 70%에서 도입유전자 수가 1copy인 것으로 나타나, 적은 수의 유전자가 안정적으로 도입됨을 확인 하였다. 3. 이러한 결과를 바탕으로, 새로운 공동배양 방법을 사용하여 우수한 농업적 형질을 가진 벼 육종 소재 및 품종을 신속하게 개발할 수 있을 것으로 기대된다.

• Applied Biological Chemistry
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• 제36권6호
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• pp.562-566
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• 1993

제라니움(Pelargonium zenale hybrids)의 원형질체에 외래유전자를 전기충격에 의해 직접도입시키는 조건을 methylene blue 염색법을 이용하여 조사하였다. 그 결과 1.77 kV/cm의 직류전압을 $40{\mu}\;sec$ 동안 가해 주는 것이 제일 효과적이었으며 이때의 원형질체 생존율은 70% 염색율은 58%이었다. 정제한 pBin19 plasmid를 전기충격법으로 원형질체에 삽입시킨 뒤 kanamycin이 포함된 배지에서 배양하였으며 원형질체의 세포분열은 KM8P 액체배지에서 제일 높았다. 윈형질체의 최적 전기융합 조건은 교류 주파수 1 MHz를 40 V/cm에서 15 sec 동안 가한 후 직류전압 0.5 kV/cm를 $60{\mu}\;sec$ 동안 처리해 준 결과 이때의 융합율과 생존율은 각각 13%, 81%이었다.

• KSBB Journal
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• 제30권6호
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• pp.307-312
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• 2015

Transgenic rice cells using RAmy3D promoter can provide high productivity, and the production of recombinant protein is induced by sugar starvation. In this system, productivity was reduced during the scale-up processes. To ensure the influences of shear stress and oxygen transfer rate, working volume and mixing performances were investigated under various agitation speeds and working volumes. In addition, inoculation methods including suspended cells and filtered cells were compared. Working volumes and shaking speeds were 300, 450 mL and 80, 120 rpm, respectively. Hydrodynamic environment of each condition was measured numerically like mixing time and $k_La$. Good mixing performance and high shear stress were measured at high agitation speed and low volume. The highest level of hCTLA4Ig was 30.7 mg/L at 120 rpm, 300 mL. When conditioned medium was used for inoculation, increased cell growth was noticed during the day 0~4 and decreased slower than filtered cells. Compared with filtered cells, the maximum hCTLA4Ig level reached 37.8 mg/L at 120 rpm, 300 mL and lower protease activity level was observed. In conclusion mixing performance is critical factor for productivity and conditioned medium can have a positive effect on damaged cells caused by hydrodynamic shear stress.

• Plant Biotechnology Reports
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• 제4권1호
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• pp.53-59
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• 2010

A specific deleted version of ARABIDOPSIS RESPONSE REGULATOR1 (ARR1) lacking the signal receiver domain (1.152 amino acids)-coding sequence, referred to as $ARR1{\Delta}DDK$, was amplified using Arabidopsis thaliana cDNA prepared from adult leaves and transferred into the genome of Nicotiana tabacum cv. Samsun under the transcriptional control of a ${\beta}$-estradiol-inducible expression system. The ectopic expression of $ARR1{\Delta}DDK$ affected the morphology of transgenic seedlings and their segments in vitro. In the presence of an inducer, ${\beta}$-estradiol, ectopic expression of $ARR1{\Delta}DDK$ induced only the formation of soft, pseudo-bulbous tissue in the root tip region of intact seedlings, which appeared similar to callus generated on a hypocotyl segment in the presence of 2,4-D and 6-benzyladenine (BA), both at $1\;{\mu}M$. Those callus tissues on the root tip region could not generate shoots unless $1\;{\mu}M$ BA was supplied. In segment culture, ectopic expression of $ARR1{\Delta}DDK$ induced calluslike tissue around the cut-end of cotyledon and hypocotyl segments with occasional shoot formation, suggesting that the expression of $ARR1{\Delta}DDK$ could substitute for the effects of cytokinin on these segments. Additionally, treatment with only ${\beta}$-estradiol induced NtWUS, a WUS ortholog in tobacco, which was detected during the process of callus tissue formation in the root tip region and also in cotyledon or hypocotyl segments. These findings suggest that the NtWUS might be associated in the transdifferentiation process caused by the functional regulation of $ARR1{\Delta}DDK$ in transgenic tobacco seedlings.

• 생명과학회지
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• 제14권6호
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• pp.1018-1022
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• 2004

Agrobacterium을 이용한 lisianthus화분의 형질전환을 위하여 적정조건을 수립하였다. 화분의 발아 및 화분관의 발달은 화분발아배지(pollen germination medium; PCM)에 sucrose를 $7-15\%$ 첨가 시키고 pH조건을 5.5-7.0으로 조절하여 $20^{\circ}C-27^{\circ}C$에서 배양할 경우 성공적으로 이루어졌다. 형질전환을 위하여 Agrobacterium 현탁액을 lisianthus화분배양액에 첨가하여 진공침윤을 20 min실시하였으며 형질전환화분은 조직화학적 분석 그리고 발현되는 GUS mRNA를 이용한 RT-PCR 및 Southern hybridization에 의한 DNA산물 분석 등에 의하여 GUS발현을 확인하였다. 이러한 결과를 통하여 화분을 이용한 일시발현기술을 제시하게 되었다.

• 한국응용곤충학회지
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• 제56권1호
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• pp.19-28
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• 2017

폴리드나바이러스(polydnavirus: PDV)는 일부 내부기생봉에 공생하는 이중나선형 DNA 바이러스 분류군이다. Cotesia plutellae bracovirus (CpBV)는 프루텔고치벌(C. plutellae)에 공생하는 일종의 PDV이다. 프루텔고치벌은 어린 배추좀나방(Plutella xylostella) 유충에 기생한다. 기생 초기에 발현하는 CpBV-ELP1 유전자는 혈구세포에 세포독성을 발휘하면서 기주의 세포성 면역을 억제하여 기생에 중요한 역할을 담당하고 있다. 본 연구는 이 유전자를 담배 식물에서 발현하여 해충에 대한 경구독성을 분석하는 데 목적을 두었다. 재조합 CpBV-ELP1 단백질이 배큘로바이러스 발현시스템을 통해 합성되어 세포배양액에 분비되었다. 수거된 세포배양액은 일련의 단백질 분리과정(ammonium sulfate 단백질 분획, size exclusion 크로마토그래피, 이온교환 크로마토그래피)을 통해 CpBV-ELP1 단백질을 분리하는 데 이용되었다. 분리된 rCpBV-ELP1 단백질은 파밤나방(Spodoptera exigua) 혈구에 대한 뚜렷한 세포독성을 보였다. CpBV-ELP1은 파밤나방 5령충에 대해서 혈강 주입하여 살충력을 나타냈고, 엽침지법을 이용하여 경구독성을 갖고 있는 것을 확인하였다. CpBV-ELP1 유전자를 CaMV 35S 유전자 프로모터와 opaline synthase 유전자 전사종결신호를 갖는 pBI121 벡터에 클로닝하여 Agrobacterium tumefaciens LBA4404 세균에 형질전환을 유도하였다. 형질전환된 세균은 담배(Nicotiana tabacum Xanthi)잎에 감염하여 캘러스를 유도하게 하였고 이후 차세대(T1)를 확보하였다. T1 세대 담배는 파밤나방에 대한 해충저항성을 갖고 있음을 확인하였다. 이러한 결과는 CpBV-ELP1 유전자가 형질전환작물을 통해 해충방제에 응용될 수 있다는 것을 제시하고 있다.

• 한국자원식물학회지
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• 제18권1호
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• pp.15-21
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• 2005

염류내성 식물은 염류농도의 변화에 따라 세포내의 삼투압을 유지하기 위한 화합물을 합성하는 기작을 가지고 있는데 이런 화합물은 주로 proline, glycine, betaine, polyols, sugar등으로 체내에 축적함으로서 고농도의 염류에 견디는 것으로 알려져 있다. Betaine은 미생물에서 2단계 반응을 통해 choline에서 합성되는데, 첫단계는 choline dehydrogenase (CDH)에 의해서 촉매되고(Bet A gene), bet B 유전자의 산물인 betaine aldehyde dehydrogenase(BADH)에 의해 수행된다. 본 실험에서는 Bet A, Bet B 유전자를 아그로박테리움에 도입하여 새로운 conjugants 2 종을 획득하였으며 (Agrobacterium tumefaciens MP90/pBet A, Agrobacterium tumefaciens MP90/pBet B), 먼저 재조합된 binary vector가 식물에서 발현 및 형질 전환되는지 여부를 조사하기 위해서 이미 담배에 형질전환을 시켰으며, 형질전환된 담배에서는 ,고농도의 kanamycin배지에서 생장이 가능하였고, PCR에 의하여 NPT II, Bet A, Bet B gene를 조사한 결과 담배 유식물체 모두 band가 형성되어 형질전환체임을 확인할 수 있었다. 인삼에 Beth, BetB gene의 도입은 1M의 mannitol이 함유된 식물호르몬 무첨가 MS 배지에서 단일배 발생방법에 형질전환체를 획득하였으나, 형질전환체의 발생빈도$(12\%)$가 매우 낮았다.