• The Plant Pathology Journal
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• 제35권1호
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• pp.19-31
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• 2019

Bud rot (BR) is the most devastating disease affecting oil palm (Elaeis guineensis) crops in Colombia. Its causal agent, Phytophthora palmivora, initiates the infection in immature oil palm leaflets producing necrotic lesions, followed by colonization of opportunistic necrotrophs, which increases disease damage. To improve the characterization of the disease, we transformed P. palmivora using Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation (ATMT) to include the fluorescent proteins CFP-SKL (peroxisomal localization), eGFP and mRFP1 (cytoplasmic localization). The stability of some transformants was confirmed by Southern blot analysis and single zoospore cultures; additionally, virulence and in vitro growth were compared to the wild-type isolate to select transformants with the greatest resemblance to the WT isolate. GFP-tagged P. palmivora was useful to identify all of the infective structures that are commonly formed by hemibiotrophic oomycetes, including apoplastic colonization and haustorium formation. Finally, we detected cell death responses associated with immature oil palm tissues that showed reduced susceptibility to P. palmivora infection, indicating that these tissues could exhibit age-related resistance. The aim of this research is to improve the characterization of the initial disease stages and generate cell biology tools that may be useful for developing methodologies for early identification of oil palm materials resistant or susceptible to BR.

• 원예과학기술지
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• 제29권4호
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• pp.345-351
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• 2011

원예작물의 내병성 육종에 있어 $F_2$와 그 이후 분리 세대에서 유용하게 사용할 수 있는 선발방법의 모델 시스템을 개발하고자 하였다. 상용 토마토 품종인 '모모따로 요크'에 제초제 저항성 유전자를 도입한 후 획득된 형질전환체의 도입 유전자 수와 후대 분리비를 분석하고, 제초제 저항성 유전자와 기존 병 저항성 유전자가 연관된 개체를 선발하였다. 총 60개의 형질전환체 중에서 42개체에 Southern blot을 실시하여 도입 유전자 수를 확인하고, 제초제 저항성 유전자에 대한 분리비를 비교 분석하여 Southern 결과와 도입된 유전자의 표현형의 분리비가 일치하지 않으며 여러 개의 copy가 삽입된 대부분의 경우, 실제 도입된 copy 수보다 더 적은 copy 수를 가지는 것처럼 분리비를 나타내는 것을 알 수 있었다. 삽입된 제초제 저항성 유전자와 기존 병 저항성 유전자가 가깝게 연관된 개체를 찾기 위해 $T_1(F_2)$세대 개체에 대하여 two-stepwise screening 방법을 실시하여 위조병 저항성 I2 유전자(11번 염색체)와 제초제 저항성 patII 유전자가 대략 12-13cM으로 가깝게 연관된 개체(T-20)를 선발하였다.

• 미생물학회지
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• 제34권3호
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• pp.120-125
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• 1998

pNPG는 염색체 1번의 동원체 왼편에 위치하는 npgA1을 상보할 수 있는 genomic DNA를 포함하는 플라스미드인데 Aspergillus nidulans의 형질전환율을 현저히 증가시키는 특징을 보여주었다. 이 플라스미드로 형질전환시켰을 때 $Trp^+$형질전환체 모두가 $Npg^+$이었고 이들 중에 불완전 형질전환체는 전혀 형성되지 않았다. pNPG를 제한효소 PstI으로 절단하여 얻어진 10.4 kb 절편내에 형질전환율을 증가시키는 DNA서열이 존재함을 확인하고 pILJ16의 PstI site에 재조합하여 pKJH10.4라 명명하였다. pKJH10.4에 의한 A. nidulans의 형질전환율은 pILJ16 보다 대략 200배 이상 증가하였다. pKJH10.4에 의한 형질전환체를 비선택적 조건에서 배양하였을 때 $Arg^+$무성생식포자의 약 80%이상이 $Arg^-$로 복귀됨으로써 플라스미드가 매우 불안정함을 보여주었다. argB2 지표와 다른 종류의 연관된 유전자 지표를 지니는 플라스미드로 형질전환하였을 경우 비선택적 조건에서 argB2 지표가 결손될 때 연관된 다른 지표도 항상 함께 결손되는 현상을 보여주었다. 이 결과는 이 플라스미드에 의한 형질전환체의 불안정성이 염색체로 삽입되었다가 절제되어 나오기 때문이기보다는 염색체 밖에서 자가 복제하기 때문임을 시사한다. 형질전환율을 증가시키는 최소한의 DNA절편은 EcoRI-HaeIII 4.9 kb 절편이었으며 PvuII-EcoRI 2.2 kb 절편은 플라스미드의 불안정성과 관련이 있었다. 이러한 결과들을 종합해 볼 때 형질전환율을 증가시키는 새로운 DNA 서열의 특성이 ANS1 보다는 AMA1과 유사하였으므로 AMA2라 명명하였다.

• 한국식품영양학회지
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• 제15권4호
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• pp.364-369
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• 2002

방선균은 토양 속에 다양하게 존재하는 미생물의 일종으로 그람 양성 진정세균으로 이차대사산물을 생산하는 시기와 포자 착생이 시작되는 세포분화의 시기가 밀접한 관련이 있다. S. griseus는 streptomycin을 비롯한 다양한 종류의 endopeptidase 및 exopeptidase들을 생산한다. 방선균에서의 protease 생산은 많은 경우에 이차대사산물이 형성되거나 형태분화가 유도되는 시기에 동시에 시작된다는 점에서 Pretense가 이차대사물질 생산 및 세포분화에 일정한 기능을 수행할 것이 라는 점을 시사하고 있다. 본 연구에서는 S. griseus IFO 13350에서 클로닝한 SGPD protease가 각 strain에서 형태학적으로나 생리적으로 어떠한 gene dosage 효과를 미치는지 조사하는 것이었다. sprD 유전자가 S.lividans를 숙주로 사용한 시스템에서 대량발현이 성공적으로 되는 것을 확인한 후, 본 유전자를 클로닝한 S. griseus IFO13350 균주와 이의 A-factor 결손주인 S. griseus HH1에 형질전환하였다. S. griseus HH1과 S. griseus IFO13350에서는 protease activity가 벡터만 도입된 대조군과 sprD 유전자가 들어간 형질전환체에서 큰 차이를 보이지 않았다. 또한 S. griseus IFO 13350 및 HH1 모두에서 생리학적·형태학적 분화의 차이를 발견하지 못하였다. Chymotrypsin계열의 pretense를 암호화하는 유전자만이 S. griseus에서 발현이 repression된다는 사실을 본 연구 결과를 통하여 알게 되었다. 이를 바탕으로 sprD유전자와 동일계열의 chymotrypsin 계열의 유전자들이 공통적으로 S. griseus에서 repression 되는 일반적인 기전이 있을 것으로 판단, chymotrypsin계열 유전자들의 promoter부분의 염기 상동성을 조사하였다 번역개시부위 바로 상부 유전자부터 상동성을 조사한 결과 적어도 상당부분의 염기배열이 잘 보존된 지역이 존재함을 알게 되었다. 향후 이들 발현기구의 조절기구를 연구함으로서 protease의 기능을 밝히는데 좋은 단서를 제공할 것으로 판단된다.

• Journal of Plant Biotechnology
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• 제35권2호
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• pp.147-153
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• 2008

국화에 담배거세미 나방 (tobacco cutworm; Spodoptera litura)에 저항성을 나타내 국화를 육성하기 위하여 cry1Ac 유전자를 형질전환하였다. Cry1Ac 유전자는 pCAMBIA2301를 포함하는 Agrobacterium C58C1을 통하여 국화 'Linneker salmon'에 도입하였다. Agrobacterium C58C1을 접종한 후 엽절편을 10 mg/L kanamycin이 함유된 재분화 배지 (MS + 1.0 mg/L BA + 0.5 mg/L IAA)에서 1차 선발을 하였고, 재분화 배지에 20 mg/L kanamycin이 첨가된 배지에서 2차 선발을 하였으며, 20 mg/L kanamycin이 첨가된 MS 배지에서 3차 발근선발을 하였다. 3차 발근선발까지 69개의 신초 (1.6%)가 생존하여 발근하였다. NptII primer로 PCR을 한 결과 그 중 36개의 신초 (0.8%)가 putative transformant로 확인되었고, Southern 분석을 한 결과, 35개체 (0.8%)가 nptII 유전자와 cry1Ac 유전자를 가진 형질전환체로 확인되었다. Cry1Ac 유전자의 형질전환율은 0.8%로 양호하였다. 온실에서 담배거세미 나방에 대한 저항성을 검정한 결과, 3개체의 형질전환체가 저항성을 나타내는 것으로 확인되었다.

• 미생물학회지
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• 제39권2호
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• pp.76-82
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• 2003

Alcaligenes faecalis T1의 Poly(3-hydroxybutyrate)(PHB) depolymerase활성 증진을 위해 DNA shuffling방법을 이용하였다. 제조된 A. faecalis T1의 PHB depolymerase 돌연변이 유전자의 library를 Pseudomonas syringae의 icenucleation protein유전자를 포함하는 발현벡터 pJHCll에 클로닝하여 약 7,000개의 형질전환체를 얻었다. 탄소원으로 PHB또는 poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate)를 포함하는 M9최소배지를 이용하여 형질전환체들로부터 활성이 서로 다른 돌연변이주들을 선별하였다. 이들의 PHB depolymease 활성은 평판배지에서의 halo형성 및 배양 상등액을 이용한 탁도 감소 실험으로 확인하였으며,형질전환체들 중에서 shuffling전의 대조군에 비하여 사용된 기질에 따라 효소활성이 1.8-3.2배 증진된 II-4 돌연변이주를 얻었다. DNA 염기서열의 분석을 통하여 II-4의 PHB depolymease에는 3개의 아미노산 치환(A1a209Va1, Leu258Phe, Asp263Thr)이 이루어졌음을 확인하였다. 여러 가지 돌연변이주의 아미노산 서열의 변화를 분석한 결과, PHB depolymerase의 catalytictriad주위에 기존 아미노산에 비하여 보다 소수성인 아미노산으로의 치환이 소수성 기질인 PHB에 대한분해 활성 중진에 기여하는 것으로 추정되었다.

• 한국미생물·생명공학회지
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• 제26권1호
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• pp.68-75
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• 1998

A. niger의 GOD(Glucose Oxidase) 대량생산과 효율적인 분비를 protein의 대량생산에 많이 사용되는 strain인 S. cerevisiae에서 시도하였다. S. cerevisiae의 ADH1과 GAL 10 promotor, 그리고 ${alpha}$-MF signal sequence와 A. oryzae의 ${alpha}$-amylase signal sequence 및 S. cerevisiae의 GAL7과 A. niger의 GOD terminator를 이용하여 4개의 expression vector를 합성한 후 S. cerevisiae 2805에 auxotroph 방법으로 형질변환시켰다. 변이체들을 배양하여 세포내와 세포외의 GOD활성도를 분석한 결과 GAL 10 promotor가 삽입된 pGAL변이체들이 ADH1 promotor가 삽입된 pADH 변이체들 보다 GOD 생산성이 높았다. GAL 10 promotor와 A. oryzae의 ${alpha}$-amylase signal sequence가 삽입된 pGALGO2에서 115시간 배양시 GOD의 생산이 가장 높았다($GOD_{total}$: 10.3 unit/mL, $GOD_{ex}$: 8.7 unit/mL). 이 수치는 같은 promotor인 GAL 10 promotor와 ${alpha}$-MF signal sequence가 삽입된 pGALGO1보다 3배정도 높다. 이 결과는 ADH 1 promotor를 사용하였을 경우에도 일치하였다. 또한 A. oryzae의 ${alpha}$-amylase signal sequence가 S. cerevisiae의 ${alpha}$-MF signal sequence보다 GOD를 더 효과적으로 분비시켰다. 상기 결과로 미루어 보면 signal sequence가 단백질의 분비 외에도 단백질 합성에도 많은 영향을 주는 것으로 추측된다. pGALGO1과 pGALGO2의 GOD분비효율은 각각 89%, 84%이었다. S. cerevisiae에서는 일반적으로 과당화가 일어나기 때문에 S. cerevisiae에서 합성된 재조합 GOD의 분자량은 250 kDa으로 A. niger의 GOD(170 kDa)보다 더 컸다.

• 생명과학회지
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• 제32권12호
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• pp.956-961
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• 2022

식물에서 재조합 단백질을 생산하는 것은 여러 가지 장점이 있다. 식물은 인간 병원체에 감염되지 않으며, 박테리아와 달리 내독소를 생산하지 않는다. 엽록체 형질전환은 핵 형질전환에 비해 안정적으로 많은 유전자를 발현시킬 수 있는 등 다양한 이점이 있다. 항균펩타이드(AMP)는 많은 동물들이 가지고 있는 선천면역의 일종으로, 소량이라도 항균력을 가지며, 기존 항생제와 다르게 쉽게 내성균이 생기지 않는다. 항균펩타이드인 moricin은 누에나방의 한 종류인 Bombyx mori에서 분리되었으며, C-말단은 염기성 아미노산이 모여 있고, N-말단은 α-helix 구조를 가지고 있다. Moricin을 생산할 때 SUMO와 6xHis tag를 융합하여 사용하였다. 발현된 moricin의 용해성과 안정성을 높이기 위해 SUMO를, 발현된 moricin을 정제하기 위하여 6xHis tag를 이용하였다. 본 연구에서 담배 엽록체와 대장균에서 항균펩타이드를 발현하기 위한 형질전환벡터를 제작하였다. 또한, 엽록체와 박테리아의 전사 및 번역의 유사성을 이용하여 대장균에서 단백질의 발현을 확인하였다. 발현된 moricin을 Ni 컬럼 및 SUMOase를 처리하여 정제하고 agar diffusion assay를 이용하여 항균 활성을 확인하였다.

• 고려인삼학회:학술대회논문집
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• 고려인삼학회 1990년도 Proceedings of International Symposium on Korean Ginseng, 1990, Seoul, Korea
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• pp.65-67
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• 1990

The sequence of ginseng peptide gene was designed and synthesized by the solid phase plasmid pUC19. Escherichia coli JM101 cells were transformed with above hybrid plasmids. Ampicillin resistant transformants were screened and identified by in situ colony hybridization and Southern blot techinques. Finally the gene sequencing was done by the Sanger dideoxy method using primer extension.

• Journal of Ginseng Research
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• 제14권2호
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• pp.207-209
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• 1990

The sequence of ginseng peptide gene was designed and synthesized by the solid phase phosphoramidiate method. Synthetic segments were isolated, pllrified and joined to the plasmid pUC19. E.icherichiu coli JM101 cells were transformed with above hybrid plasmids. AmpiciIBin resistant transformants were screened and identified by in situ colony hybridization and Southern blot techniques. Finally the gene sequencing was done by the Sanger dideoxy method using primer extension.