Inflammatory cells may produce active species of oxygen in antimicrobial defense. While such species can directly damage surrounding tissue, their major secondary role may be to mediate important components of the inflammatory response. Superoxide dismutase, antioxidant, have significant anti-inflammatory properties in rheumatoid arthritis, ischemic tissue injury and gastrointestinal disease. Increased oxidative product formation diseases. And superoxide dismutase produced by Porphyromonas Gingivalis is resistant to killing by polymorphonuclear leukocyte. The purpose of this study was to investigate on the effects of superoxide dismutase in 3T3 fibroblast and in experimental gingivitis in the rats. The effect of superoxide dismutase(SOD) to cell morphology and cell activity was measured in cultured mouse 3T3 fibroblast. After experimental gingivitis were induced by lipopolysaccharide(LPb) and bovine serum albumin(BSA), injection of SOD were done. WBC count and histologic findings were observed at 1, 2, 3, and 7 days. The results were as follows; 1. There was a little difference between LPS treated groups and SOD treated groups in 3T3 fibroblast morpholoy. 2. There was no difference between only SOD treated groups (except SOD 150U at 3days) and control in 3T3 fibroblast activity. 3. LPS $0.5{\mu}g/ml$ and SOD treated groups (except 150U) had decreased 3T3 fibroblast activity and no significant difference at 3 days. 4. LPS $5.0{\mu}g/ml$ and SOD treated groups were significantly increased cell activity of 3T3 fibroblast than control group at 1 day(P<0.05). 5. In LPS induced gingivitis, the number of leukocytes in SOD treated was significantly decreased than in saline treated at 1 day(P<0.05). 6. In histopathologic findings of LPS or BSA induced gingivitis, inflammatorycell infiltration in SOD treated groups were less than in saline treated group at 1, 2 and 3 days.
본 연구에서는 절대적 호기성인 Vitreoscilla가 지닌 FeSOD의 특성을 밝히고자 paraquat와 iron을 사용하여 실험하였다. Vitreoscilla에서 FeSOD의 활성도는 초산화 음이온을 생성하는 paraquat에 대해 커다란 영향 없이 일정하게 발현되었다. 이 결과는 Vitreoscilla는 호기적인 물질대사 동안 생성되어지는 초산화 음이온에 대해 방어할 수 있을 만큼 충분한 FeSOD를 평상시 지니고 있음을 의미한다. 또한 다른 요소에 의한 FeSOD의 발현 가능성이 고려되어졌다. 보조 인자인 Fe 를 처리한 결과 활성도가 증가됨을 알 수 있었다. 이는 CN-resistant respiration을 증가시키는 초산화 음이온에 대한 조절 기작과는 달리 apoenzyme 상태가 보조 인자인 금속 이온 (Fe)에 의해 holoenzyme 상태로 전환되었음을 의미한다. PQ와 Fe를 함께 처리하였을 경우, FeSOD의 증가는 PQ에 의해서 생성된 초산화 음이온에 의해 apo 상태에서 hole 상태로 FeSOD의 활성이 증진되는 synergism effect로 설명되어진다. 결론적으로 metalloenzyme인 SOD의 경우는 이런 전환이 활성 속도를 제한하거나 조절할 수도 있는 posttranslational 수준의 조절 기작이 존재함을 알 수 있었다.
세포질 내 칼슘 농도의 증가는 다형핵 백혈구의 산화성 대사를 자극하는 주요 인자로 여겨지고 있다. 활성화된 다형핵 백혈구로부터 lysosomal enzyme의 유리는 세포내 cyclic nucleotide농도에 따라 조절될 수 있지만 신경전달물질과 ${\beta}$-아드레날린 또는 무스카린성 수용체의 결합에 따른 그밖의 반응은 아직도 분명하지 않다. 덧붙여, ${\alpha}$-아드레날린성 수용체의 중개에 의한 다형핵 백혈구의 기능은 알려져 있지 않다. Atropine, phentolamine과 propranolol은 활성화된 다형핵 백혈구의 칼슘흡수, superoxide 생성, NADPH oxidase 활성도 그리고 식작용을 억제하였으며, 이에 반하여 carbachol과 isoproterenol은 활성화된 세포의 반응을 약간 더 자극하였다. Carbachol또는 isoproterenol 의하여 항진된 superoxide 생성은 각각 그들의 길항제인 atropine과 propranolol 의하여 억제되었다. 활성화된 다형핵 백혈구의 반응은 chlorpromazine, verapamil과 dantrolene에 의하여 억제되었으나 lithium에 의 하여 약긴 항진되었다. 한편 chlorpromazine과 dibucaine은 NADPH oxidase 활성도에 영향을 주지 않았다. Atropine, phentolamine과 propranolol은 칼슘에 의존적인 식작용을 억제 하였다. 이상의 결과로부터 atropine, phentolamine과 propranolol은 칼슘 유입을 억제하고 자율 신경계의 수용체와 연관이 있는 NADPH oxidase계에 직접 작용함으로써 활성화된 다형핵 백혈구로부터 superoxide 생성을 억제할 것으로 시사되었다.
식물의 저온 스트레스와 이에 대한 방어체계의 기작론적 측면을 탐색하기 위하여, 냉해유발조건하에서 세워둔 식물(주로 3-4엽기의 벼 유묘)를 대상으로 하여 조직중 pyruvate 함량, superoxide$(O_{\overline{2}})$ 수준 및 항산소성 효소들의 활성을 경시적으로 측정하였다. 저온$(5^{\circ}C)$처리동안에 엽조직에는 현저한 pyruvate축적이 일어났으며, 그 상대적 축적량은 처리시간의 경과에 따라 증가하였다. 그러나 저온처리된 식물을 상온하에 옮겨 놓았을 때 축적된 pyruvate는 곧 소진하기 시작하였으며 이와 동시에 조직내 superoxide$(O_{\overline{2}})$수준이 상승하기 시작하였다. 아울러, 몇시간 정도의 lag time을 가지며 superoxide dismutase(SOD)와 catalase의 활성도 증가하였다. 이에 반하여 또 다른 항산소성 효소인 Glutathione peroxidase는 활성화 현상을 전혀 보이지 않았다. 뿌리를 통해서 외부로부터 공급된 superoxide$(O_{\overline{2}})$는 뿌리 조직내의 SOD와 catalase의 활성을 유도하였다. 한편 $H_2O_2$ 공급이 조직내 catalase는 활성화시켰으나, 역시 glutathione peroxidase에 대해서는 어떤 영향도 미치지 않았다. 위의 모든 결과들은 저온처리중에 일어난 pyruvate의 세포내 축적이 상온으로 환원된 조직내에서 superoxide$(O_{\overline{2}})$ 및 이로부터 이차적으로 생성된 활성산소를 과잉 발생시키는 직접적 원인이라는 사실과, 두 항산소성 효소(SOD와 catalase)가 활성산소를 중간매체로 하여 일어나는 것으로 해석되는 식물냉해로부터 세포를 보호함에 있어서 결정적인 역할을 담당하고 있다는 사실을 강력히 시사하였다.
Escherichia coli 의 superoxide 라디칼 유도발현성 유전자의 탐색을 위하여 먼저 superoxide 라디칼에 의하여 발현이 유도되는 프로모터를 탐색하였다. 이를 위햐여, 프로모터 탐색벡터인 pJAC4 를 이용하여 E. coli MG1655 균주로부터 프로모터 library 를 구성하였다. Ampicillin 농도구 배정판법을 이용하여 프로모터 세기가 다른 클론들을 구별하여 프로모터 세기가 약한 것부터 중간정도까지 383개의 클론을 선별하였다. 이들 프로모터 클론들의 superoxide 라디칼 유도발현성을 paraquat 를 첨가한 ampicilin 농도구배평판에서 조사하였다. 이중 3개의 클론이 paraquat 에 의하여 유도됨을 확인하였고, 유도배율은 1.4-4배 정도이었다. 이들 프로모터의 염기서열을 결정한 결과 기종의 database 에 등록되어 있는 E. coli 염기서열들과는 다른 새로운 유전자임을 알았다. 이들 프로모터에 대하여 primer 연장법과 SS1 뉴클리아제 분석을 총하여 전사개시 자리를 결정하였고, paraquat 처리시 mRNA 의 양이 증가함을 관찰하였다. 특히 클론5의 경우는 두개의 전사개시 위치를 가지고 있으며, paraquat 처리시 상위 부분의 전사개시자리가 성택적으로 사용됨을 알 수 있었다. 프로모터 서열을 검색한 결과, RNA 중합효소($E\sigma^{70}$)에 의햐여 인지되는 -10과 -35부위를 가진 클론은 클론 5 뿐이었고, 나머지는 보존된 염기서열을 찾을 수 없었다. 이는 이들 프로모터들이 독특한 부류에 속하는 종류들로서, 새로운 전사조절인자를 요구할 가능성을 시사한다.
내피세포가 제거된 토끼의 적출 장간막 동맥에서 토끼의 대동맥 내피세포로 부터 A23187과 acetylcholine은 NO와 유사한 혈관 이완성 물질 (EDRF)을 유리한다. 이에 첨가하여 A23187은 acetylcholine과는 달리 superoxide anion에 의하여 파괴되지 않는 EDRF도 유리시킴을 확인하고 이의 특성에 대하여 연구하였다. 정상적인 생리영양액에서는 A23187과 acetylcholine의 용량-반응 곡선은 내피세포에 의존하지 않는 sodium nitroprusside의 곡선과 유사하였다. 이들은 methylene blue에 의하여 억제되었다. Hypoxanthine (HX)과 xanthine oxidase (XO)를 bath내로 투여시 phenylephrine에 의한 수축이 일과성으로 증가한 후 지속적으로 이완되었다. HX-XO 반응중에는 A23187은 장간막 동맥을 즉각적으로 이완시켰으나 acetylcholine의 이완작용은 소실되었다. A23187에 의하여 야기되는 장간막동맥의 이완은 50 mM $K^+-PSS$로 수축을 야기시켰을 때에는 나타나지 아니하였다. Superoxide dismutase를 전처치하였을 때는 HX-XO 반응중에도 acetylcholine 뿐만아니라 A23187에 의한 장간막 동맥의 수축은 이완되었다. 한편, acetylcholine에 의하여 야기되는 장간막 동맥의 이완은 A23187에 의하여 야기되는 이완에 비하여 phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)에 훨씬 더 민감하게 억제되었다. 내피세포의 기능과는 무관한 sodium nitroprusside에 의하여 야기되는 이완은 PMA에 의하여 영향을 받지 아니하였다. 이상의 결과로 미루어 볼때, A23187과 acetylcholine은 methylene blue에 의하여 억제되는 내피세포 의존성 이완을 야기시키고, 첨가하여 A23187은 어떤 병적 환경 아래서는 superoxide anion과 PMA에 저항성을 지닌 혈관이완성 물질을 유리하는 것으로 사료된다. 앞으로 A23187에 의하여 유리되는 혈관 이완성 물질이 superoxide anion에 의존하여 생성된 것인지에 대하여는 추후의 연구과제이다.
지질산화생성물에 의한 DNA손상작용 및 그 억제 기구를 밟히기 위하여 linoleic acid와 plasmid DNA와의 모델계를 통하여 검토하였는데, 그 결과를 요약하면 다음과 같다. 1. Linoleic acid의 산화에 의하여 DNA가 손상되었으며, 그 정도는 linoleic acid의 양이 많을 수록 크게 나타났다. 2. Linoleic acid의 산화에 의한 DNA손상작용은 POV 100 mea/kg이하인 산화초기에서도 빠르게 진행되었다. 산화초기의 DNA손상작용에는 활성산소 종의 관여가 크게 나타났는데, 그 중에서도 일중항 산소와 superoxide anion의 영향이 큰 것으로 나타났다. 3. 지질 2차반응생성물인 malonaldehyde와 hexanal의 DNA손상작용은 linoleic acid경우와는 달리 활성산소종과는 무관하였으며 DNA와 와의 복합체형성에 의하였다. 4. Linoleic acid hydroperoxide의 DNA 손상작용은 linoleic acid의 초기신화에 의한 DNA손상작용 보다 크게 나타났고, 활성산소종의 영향은 없었다. 5. 지진산화생성물에 의한 DNA손상 작용은 천연 항산화성분(마늘 및 생강추출물) 및 활성산소소거제($\alpha-tocopherol 및 superoxide dismutase$의 첨가에 의하여 크게 억제되었다. 특히 . 마늘 및 생강추출물은 활성산소종의 생성을 비롯하여 공액 diene 및 POV의 증가 또한 크게 억제하였다.
초파리를 이용하여 superoxide dismutase (SOD) 유사활성이 높다고 알려진 식물체 12 종의 효능을 평가하였다. 평가방법으로는 초파리 체내에서 superoxide를 발생시켜 초파리를 죽게 하는 paraquat (Pq)를 초파리 식이에 공급하고 상기 식물체 추출물을 투여하였을 때 초파리의 배양시간에 따른 생존율을 비교하여 분석하였다. Pq와 함께 마늘, 상치, 키위, 팽이버섯 추출물을 동시에 공급하였을 때 이들은 산소상해를 받고 있는 초파리에 비해 효과를 나타내지 못하였다. 그러나, 이들 식물체를 함유한 배지에 10일간 미리 적응시킨 후 식물체를 계속 공급하면서 60 mM 농도로 Pq를 함께 공급하였을 때 배양 1일 후 Pq 처리구의 생존율은 약 11%였으나 식물체 첨가구의 생존율은 $35{\sim}63%$로 높게 나타났다. 즉, 미리 적응시키면 SOD 유사활성이 있는 식물체는 초파리가 활성산소에 노출되더라도 산소독성에 예방효과를 나타낼 수 있음을 시사하고 있다. 한편, 초파리를 20 mM의 Pq가 첨가된 배지에 노출시켜 산소상해를 입히고 생존한 초파리만을 모아 60 mM의 Pq와 식물계 추출물이 함께 첨가된 배지로 옳기고 2일 후 생존율을 측정하였을 때 Pq첨가구 초파리의 생존율은 32%였으나 상치, 키위, 팽이버섯, 양파, 감, 고사리, 폴리플라워 첨가구 초파리의 생존율은 $64{\sim}82%$로 나타났다. 결과적으로 이들 식물체는 산소상해에 대하여 일종의 치유효과를 나타내는 것으로 판단되었다. 조사한 식물체 중 미나리, 표고버섯, 느타리 버섯, 브로콜리는 치유효과를 발휘하지 못하였다.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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