• Tuberculosis and Respiratory Diseases
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• 제57권2호
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• pp.125-131
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• 2004

결핵균 감염에 대한 주요 방어 항원 물질로서 항원 85 복합체(Ag85A, B, C)가 주목되고 있다. 우리는 이들 항원들을 과발현하는 재조합 BCG를 클로닝하였고, 마우스 모델을 이용하여 결핵균 감염에 대한 재조합 BCG의 방어 효능을 알아보고자 하였다. 항원 85A를 과발현하는 재조합 BCG를 rBCG/FA, 항원 85B를 과발현하는 재조합 BCG를 rBCG/FB, 그리고, 이들 두 항원을 과발현하는 재조합 BCG를 rBCG/B.FA라고 명명하였고, 이들 항원들의 과발현 여부를 SDSPAGE상에서 확인한 결과, 재조합 BCG에서 항원 85A와 B 단백질이 BCG에 비해 과발현된 것을 알 수 있었다. 면역주사한 마우스에서 분리한 비장세포를 M. tuberculosis H37Rv의 culture filtrate protein(CFP)으로 자극하여 분비된 IFN-${\gamma}$ 농도를 측정한 결과에서는 rBCG/B.FA만이 BCG에 비해 높은 IFN-${\gamma}$ 농도를 나타내었으나, 마우스 모델을 이용한 결핵균 감염에 대한 재조합 BCG의 방어 효능 실험에서는 BCG와 뚜렷한 차이를 나타내지 못하였다.

• Tuberculosis and Respiratory Diseases
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• 제60권2호
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• pp.187-193
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• 2006

배 경 : 결핵균의 성장 속도가 늦은 이유가 mammalian cell이나 대장균에 비해 결핵균 AK의 매우 낮은 활성도에 의한 것이라는 추측으로부터 AK1과 유사한 촉매능을 나타내는 AKmt 돌연변이 유전자와 human muscle-type AK 합성 유전자(AK1)를 각각 Mycobacterium/E.coli 발현벡터에 재조합(pMVAKmtDM, pEMAK1)하여 성장 속도가 매우 느린 BCG에 형질전환함으로써 이들 단백질들의 촉매능에 의한 성장 속도 변화가 일어나는지를 확인하고자 하였다. 방 법 : Human AK1의 촉매 활성도와 유사하도록 결핵균 AK (AKmt)유전자의 ATPbd와 LID domain을 돌연변이하여 제조한 유전자(AKmtDM)와 human muscle-type adenylate kinase 합성 유전자(AK1)를 Mycobacterium/E.coli 발현벡터에 클로닝하여 재조합 BCG를 제조하였고, 이들 재조합 BCG와 BCG Pasteur $1173P_2$ (wild-type)를 7H9 액체배지에 접종하여 2-3 일 간격으로 $A_{600}$ 값을 측정하였다. 결 과 : 재조합 BCG의 성장 속도는 Wild-type BCG의 성장 속도에 비해 변화가 없었다. 결 론 : 결핵균 adenylate kinase의 정확한 기능은 알 수 없으나, adenylate kinase의 촉매 활성도의 증가는 BCG의 성장 속도에는 영향을 주지 않는 것으로 판단된다.

• Parasites, Hosts and Diseases
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• 제52권3호
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• pp.251-256
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• 2014

A novel recombinant Bacille Calmette-Guerin (rBCG) vaccine co-expressed Eimeria tenella rhomboid and cytokine chicken IL-2 (chIL-2) was constructed, and its efficacy against E. tenella challenge was observed. The rhomboid gene of E. tenella and chIL-2 gene were subcloned into integrative expression vector pMV361, producing vaccines rBCG pMV361-rho and pMV361-rho-IL2. Animal experiment via intranasal and subcutaneous route in chickens was carried out to evaluate the immune efficacy of the vaccines. The results indicated that these rBCG vaccines could obviously alleviate cacal lesions and oocyst output. Intranasal immunization with pMV361-rho and pMV361-rho-IL2 elicited better protective immunity against E. tenella than subcutaneous immunization. Splenocytes from chickens immunized with either rBCG pMV361-rho and pMV361-rho-IL2 had increased $CD4^+$ and $CD8^+$ cell production. Our data indicate recombinant BCG is able to impart partial protection against E. tenella challenge and co-expression of cytokine with antigen was an effective strategy to improve vaccine immunity.

• Pediatric Infection and Vaccine
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• 제4권1호
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• pp.106-115
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• 1997

목 적 : B형 간염 바이러스 보균자가 많은 우리 나라에서는 모든 신생아에게 B형 간염에 대한 능동면역이 시행되고 있다. 혈장 백신은 공급원에 한계가 있고 전염성 질환이 전파될 가능성이 있으며 값이 비싸다는 문제점이 있어 이와는 다른 유전자 재조합 공법으로 생산된 HG-II$^{(R)}$백신의 면역원성과 안전성을 조사하고 BCG 선행군과 그렇지 않은 군에서의 면역원성을 비교하고자 본 연구를 시행하였다. 방 법 : 1995년 4월부터 1996년 6월까지 경상대학병원(Group A), 지방공사 강남병원 (Group B)과 영동 세브란스병원(Group C)에서 10세이하의 소아를 대상으로 하여 유전자 재조합 B형간염 백신(HG-II$^{(R)}$)$10{\mu}g$의 양을 0, 1, 6개월 접종 방식으로 3회 근주 하였다. 4군는 BCG를 간염 2차 접종하기 1주전에, B군은 1주후에 접종하였다. C군에서는 두가지 예방접종의 선후관계를 알 수 없었다. 3회 접종후 1개월에 채혈하여 anti-HBs Ab를 측정하였으며 부작용을 조사하였다. 결 과 : 1) 총 114례중 신생아는 104례였으며 이 중 55례는 간염 2차 접종하기 1주전에 BCG를 접종하였고 43례는 간염 2차 접종후에 BCG를 접종하였으며, 6례는 선후관계를 알 수 없었다. 2) 항체양전율은 99.1%였고 기하 평균 항체가는 131.2mIU/ml였다. 3) BCG를 간염 2차 접종하기 1주전에 접종한 군과 1주후에 접종한 군에서의 기하 평균 항체 가는 각각 105.5mIU/ml, 162.8mIU/ml였다(p<0.025). 4) 부작용은 국소 반응이 1.4%, 전신 반응이 7.8%였다. 결 론 : 유전자 재조합 간염 백신은 부작용이 적고 면역원성이 우수하였다. 간염 2차 접종 전에 BCG를 접종한 군에서의 기하 평균 항체가가 낮게 관찰된 바 향후 이에 대한 연구가 더 필요할 것으로 사료된다.

• 대한미생물학회지
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• 제34권6호
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• pp.555-559
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• 1999

The 38 kDa protein of Mycobacterium tuberculosis, which was known previously as antigen 5, has been extensively used in the serodiagnosis of tuberculosis. In an attempt to develop and evaluate a serodiagnostic test using the antigen, we expressed the 38 kDa protein in BCG and its seroreactivity was compared to that expressed in Escherichia coli. The coding region of the 38 kDa protein was amplified by PCR, and the gene was cloned into a Mycobacterium-E. coli shuttle expression vector pYMC-his and pQE30 expression vector and expressed in BCG and E. coli, respectively. Both recombinant 38 kDa proteins showed strong seroreactivity against pooled serum from tuberculosis patients. There was no significant difference in seroreactivity between the two recombinant antigens in sera from the far advanced tuberculosis patients. However, of 25 tuberculosis patients graded as "minimal" by chest X-ray, 5 (20.0%) were seropositive by r38 kDa expressed in E. coli, while 8 (32.0%) by that expressed in BCG. Likewise, higher seroreactivity by r38 kDa expressed in BCG was found in sera from the moderately advanced tuberculosis. This study thus indicates that the recombinant 38 kDa expressed in BCG is more effective than that expressed in E. coli in detecting antibodies to the native 38 kDa protein of M. tuberculosis in sera from minimally affected tuberculosis patients.

• BMB Reports
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• 제34권4호
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• pp.342-346
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• 2001

The Mycobacterium bovis BCG panB gene, encoding ketopantoate hydroxymethyltransferase (KPHMT), was cloned from a ${\lambda}gt11$ genomic library and sequenced. The DNA sequence encodes a protein that contains 281 amino acid residues (M, 29,337) with a high similarity to the KPHMTs. Subcloning of a 846 by open reading frame (ORF), but not a 735 by ORF, into the vector pUC19 led to complementation of the panB mutant of Escherichia coli. The BCG pang gene was overexpressed in E. coli and the KPHMT purified to homogeneity The recombinant protein was further confirmed by an enzymatic assay.

• Journal of Microbiology and Biotechnology
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• 제28권6호
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• pp.1022-1029
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• 2018

Tuberculosis (TB) remains a serious health issue around the word. Adenovirus (Ad)-based vaccine and modified vaccinia virus Ankara (MVA)-based vaccine have emerged as two of the most promising immunization candidates over the past few years. However, the performance of the homologous and heterologous prime-boost immunization regimens of these two viral vector-based vaccines remains unclear. In the present study, we constructed recombinant Ad and MVA expressing an Ag85B-TB10.4 fusion protein (AdH4 and MVAH4) and evaluated the impact of their different immunization regimens on the humoral and cellular immune responses. We found that the viral vector-based vaccines could generate significantly higher levels of antigen-specific antibodies, $IFN-{\gamma}$-producing splenocytes, $CD69^+CD8^+$ T cells, and $IFN-{\gamma}$ secretion when compared with bacillus Calmette-$Gu{\acute{e}}rin$ (BCG) in a mouse model. AdH4-containing immunization regimens (AdH4-AdH4, AdH4-MVAH4, and MVAH4-AdH4) induced significantly stronger antibody responses, much more $IFN-{\gamma}$-producing splenocytes and $CD69^+CD8^+$ T cells, and higher levels of $IFN-{\gamma}$ secretion when compared with the MVAH4-MVAH4 immunization regimen. The number of $IFN-{\gamma}$-producing splenocytes sensitive to $CD8^+$ T-cell restricted peptides of Ag85B (9-1p and 9-2p) and Th1-related cytokines ($IFN-{\gamma}$ and $TNF-{\alpha}$) in the AdH4-MVAH4 heterologous prime-boost regimen immunization group was significantly higher than that in the other viral vector-based vaccine- and BCG-immunized groups, respectively. These results indicate that an immunization regimen involving AdH4 may have a higher capacity to induce humoral and cellular immune responses against TB in mice than that by regimens containing BCG or MVAH4 alone, and the AdH4-MVAH4 prime-boost regimen may generate an ideal protective effect.

• Tuberculosis and Respiratory Diseases
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• 제58권2호
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• pp.142-152
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• 2005

배 경 : 최근 결핵에 대한 새로운 백신 개발은 초회 면역 방법 및 추가 면역 방법을 이용하는 방향으로 연구되고 있다. 본 실험은 새로운 백신 후보 물질로서의 가능성을 알아보기 위하여 결핵균 adenylate kinase (AK), nucleoside diphosphate (NdK) 및 heat shock protein 70(Hsp70)의 결핵균에 대한 방어면역효능을 측정하였다. 방 법 : 재조합 단백질들을 정제하기 위하여 중합효소 연쇄반응으로 증폭한 결핵균 유전자 단편들을 E.coli expression vector, pQE30에 클로닝한 후, Ni-NTA resin을 이용하여 정제하였다. DDA와 재조합 단백질들을 마우스에 면역주사하고 면역반응 생성 유무를 확인하기 위하여 항체와 $IFN-{\gamma}$ 생성능을 측정하였다. 면역주사 한 마우스에 결핵균을 공기 감염시킨 후, 폐와 비장을 분리하여 결핵균 생균수 실험을 하였다. 결 과 : 재조합 단백질 AK, NdK 와 Hsp70을 면역보강제인 DDA를 이용하여 면역주사 한 결과에서, 생리식염수 혹은 DDA를 면역주사 한 마우스에 비교하여 재조합 단백질을 면역주사 한 마우스에서는 각 항원에 대해 항체와 $IFN-{\gamma}$ 생성능이 높게 나타났으나 결핵균에 대한 효과적인 방어면역효능은 나타나지 않았다. 결 론 : 마우스를 모델로 한 결핵균에 대한 방어면역효능 실험에서, 면역보강제 DDA를 이용한 재조합 단백질 AK, NdK 및 Hsp70을 면역주사 한 경우에는 결핵균의 성장을 효과적으로 조절하지 못하였다. 혼합 단백질 혹은 다른 T세포 면역보강제의 사용에 의한 추시가 필요하다.

• Tuberculosis and Respiratory Diseases
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• 제52권5호
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• pp.497-505
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• 2002

연구배경 : 결핵의 방어면역에서 IFN-${\gamma}$는 매우 중요한 역할을 한다. IFN-${\gamma}$ 수용체의 완전결손이 있는 환자는 Mycobacterium 감염에 감수성이 높아서 매우 치명 적이다. 매우 드문 일부 Mycobacterium 감염에서 IFN-${\gamma}$ 수용체의 완전결손 외에 여러 종류의 부분결손들과 STAT1의 돌연변이들이 알려져 있다. 특히, IFN-${\gamma}$ 수용체의 부분결손이 있는 환자들의 경우 병리학적 소견파 임상적 경과가 일반적 결핵과 유사한 소견을 보이는 것으로 알려져 있다. 방 법 : 임상적 결핵환자에서 IFN-${\gamma}$ 수용체의 기능을 평가하여 대조군과 비교하였다. IFN-${\gamma}$ 수용체의 이상이 있을 가능성이 가장 높은 파종성 결핵환자의 DNA에서 앞서 발표된 증례들에서 확인된 IFN-${\gamma}$ 수용제와 STAT1의 유전적 이상을 확인하였다. 결 과 : 말초혈액 단핵구를 recombinant IFN-${\gamma}$ (100, 1000IU/ml)로 자극하였을 때 대조군과 환자군에 모두 HLA-DR과 CD64의 발현이 증가하였으나, 두 군간의 차이는 없었다. 대조군과 환자군에서 모두 LPS자극하였을 때 TNF-${\alpha}$의 생산이 증가하였으며 IFN-${\gamma}$로 전처치 후에 다시 LPS로 자극하였을 때 TNF-${\alpha}$의 생산은 더욱 더 증가하였다. 그러나, 두 군간의 통계적으로 유의한 차이는 없었다. 파종성 결핵 환자에서 기존에 알려진 IFNgR1과 STAT1의 돌연 변이를 확인하였을 때 특이한 이상소견을 발견할 수 없었다. 결 론 : 임상적 결핵에서 IFN-${\gamma}$ 수용체의 기능적 및 유전적 이상을 확인할 수 없었다. 기존의 연구에서 BCG와 NTM 감염과 관련 있는 것으로 알려진 IFN-${\gamma}$수용체의 이상 만으로는 임상적 결핵의 개체감수성을 설명할 수 없었다.