• Genomics & Informatics
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• 제21권4호
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• pp.52.1-52.10
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• 2023

Accurate and efficient microbial diagnosis is crucial for effective molecular diagnostics, especially in the field of human healthcare. The gold standard equipment widely employed for detecting specific microorganisms in molecular diagnosis is quantitative real-time polymerase chain reaction (qRT-PCR). However, its limitations in low metagenomic DNA yield samples necessitate exploring alternative approaches. Digital PCR, by quantifying the number of copies of the target sequence, provides absolute quantification results for the bacterial strain. In this study, we compared the diagnostic efficiency of qRT-PCR and digital PCR in detecting a particular bacterial strain (Staphylococcus aureus), focusing on skin-derived DNA samples. Experimentally, specific primer for S. aureus were designed at transcription elongation factor (greA) gene and the target amplicon were cloned and sequenced to validate efficiency of specificity to the greA gene of S. aureus. To quantify the absolute amount of microorganisms present on the skin, the variable region 5 (V5) of the 16S rRNA gene was used, and primers for S. aureus identification were used to relative their amount in the subject's skin. The findings demonstrate the absolute convenience and efficiency of digital PCR in microbial diagnostics. We suggest that the high sensitivity and precise quantification provided by digital PCR could be a promising tool for detecting specific microorganisms, especially in skin-derived DNA samples with low metagenomic DNA yields, and that further research and implementation is needed to improve medical practice and diagnosis.

• 한국미생물·생명공학회지
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• 제38권2호
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• pp.158-162
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• 2010

고온균 Thermus thermophilus HJ6 유래의 N-말단 결실 Tod polymerase($\Delta$Tod polymerase)는 온도 감수성 프로모터 (lambda pR and pL)를 포함하는 pJLA503 벡터를 이용하여 대장균에서 발현하였다. N-말단 250개 아미노산이 제거된 $\Delta$Tod polymerase는 5'$\rightarrow$3' exonuclease 활성은 없어지고 DNA 중합반응의 활성은 그대로 유지되었다. $\Delta$Tod polymerase는 $MgCl_2$의 존재 하에서 매우 효율적으로 역전사 반응과 PCR 반응을 수행하였다. 또한 $\Delta$Tod polymerase는 one-step RT-PCR 반응에서 Taq polymerase 보다 높은 cDNA 증폭 효율을 나타내었다.

• Korean Journal of Radiology
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• 제21권4호
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• pp.505-508
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• 2020

The epidemic of 2019 novel coronavirus, later named as severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2), is still gradually spreading worldwide. The nucleic acid test or genetic sequencing serves as the gold standard method for confirmation of infection, yet several recent studies have reported false-negative results of real-time reverse-transcriptase polymerase chain reaction (rRT-PCR). Here, we report two representative false-negative cases and discuss the supplementary role of clinical data with rRT-PCR, including laboratory examination results and computed tomography features. Coinfection with SARS-COV-2 and other viruses has been discussed as well.

• Journal of Microbiology and Biotechnology
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• 제22권9호
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• pp.1301-1306
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• 2012

We combined real-time RT-PCR and real-time PCR (R/P) assays using a hydrolysis probe to detect Mycobacterium tuberculosis complex (MTBC)-specific 16S rRNA and its rRNA gene (rDNA). The assay was applied to 28 non-respiratory and 207 respiratory specimens from 218 patients. Total nucleic acids (including RNA and DNA) were extracted from samples, and results were considered positive if the repeat RT-PCR threshold cycle was ${\leq}35$ and the ratio of real-time RT-PCR and real-time PCR load was ${\geq}1.51$. The results were compared with those from existing methods, including smear, culture, and real-time PCR. Following resolution of the discrepant results between R/P assay and culture, the overall sensitivity, specificity, positive predictive values (PPV), and negative predictive values (NPV) of all samples (including non-respiratory and respiratory specimens) were 98.2%, 97.2%, 91.7%, and 99.4%, respectively, for R/P assay, and 83.9%, 89.9%, 72.3%, and 94.7%, respectively, for real-time PCR. Furthermore, the R/P assay of four patient samples showed a higher ratio before treatment than after several days of treatment. We conclude that the R/P assay is a rapid and accurate method for direct detection of MTBC, which can distinguish viable and nonviable MTBC, and thus may guide patient therapy and public health decisions.

• 한국자원식물학회지
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• 제16권1호
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• pp.40-48
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• 2003

C. destructans는 인삼에서 가장 문제가 되고 있는 뿌리섞음병을 유발하는 매우 중요한 미생물이다. 현재까지 정상적인 인삼포장이나 폐포지에서도 이 병원균의 농도를 조사할 만한 방법이 없어 이를 쉽게 조사함으로서 인삼 예정지 관린시 도움을 줄 수 있는 새로운 방법이 절실이 요구되고 있다. 본 연구에서는 nested PCR이란 분자생물학적 방법을 이용하여 효과적으로 매우 낮은 농도의 C. destructans을 검출할 수 있는 방법을 개발하였다. 2개의 universal ITS primers(ITS5F와 ITS4R)을 사 용 하 여 Cylindrocarpon spp.의 rDNA로부터 ITS영역을 증폭하였다. 이어 C. destructans의 specific primer(Nest 1 과 Nest 2)을 사용하여 최적의 PCR조건으로 재증폭시켜 밴드를 확인하였다. 또한 이런 2번의 과정을 4개의 primer를 동시에 사용함으로서 한번에 확인할 수 있는 방법을 개발하였으며 이에 따른 PCR조건도 확립하였다. 따라서 본 방법에 의해서 인삼포장의 토양에서 채취된 매우 낮은 농도의 wild type C. destructans spore로부터 성공적으로 positive band을 확인함으로써 추후 인삼포장의 선정 및 4년생에서 6년까지(홍삼포) 재배기간등의 예측에 활용 될 것으로 생각된다.

• 한국어병학회지
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• 제24권3호
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• pp.255-268
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• 2011

본 연구에서는 RT-nested PCR을 수행하여 부산 도심의 하천 중 동천에 존재하는 노로바이러스를 검출하고자 하였다. 기존에 보고되어진 노로바이러스의 capsid protein의 염기서열을 비교하여 노로바이러스 genogroup I,II (GI,II) 를 검출하기 위한 새로운 degenerated primer sets (PNK, KGIF/KGIR and KG2F/KG2R) 를 제작하였으며, 채수한 동천 시료를 초고속원심분리기를 통해 농축 후 물 속에 존재하는 노로바이러스의 검출을 시도하였다. 노로바이러스를 검출하기 위해 PCR primer를 비교한 결과 본 연구에서 제작한 capsid protein gene을 target으로 하는 primer set가 기존에 보고되어 있는 primer set보다 동일 시료에 대한 검출빈도가 우수하였다. 동천에 존재하는 노로바이러스의 오염 수준은 GI과 GII가 각각 76.47% (13/17), 70.59% (12/17) 로 나타났다. 그러나 기존에 알려진 primer와 본 연구에서 제작한 primer를 사용하였을 때 검출된 양성비율이 차이가 나지 않았다. 검출된 노로바이러스를 염기서열 비교를 통한 계통 발생학적 분석 결과, 동천에서 검출된 GI의 경우 1/2/4/5/9/10의 genotype이 GII의 경우 3/4/5/11/13의 genotype으로 분류되었다. 그리고 본 연구에서 검출된 major type 중 GII/4의 경우, 최근 아시아 각국에서 많은 문제를 일으키고 있는 major genotype으로 알려져 노로바이러스에 대한 위험성을 제고하게 하였다. 또한, 이러한 결과는 국내의 강, 호수, 하천 등이 비슷한 노로바이러스의 GI,II의 genotype으로 오염되어 있음을 암시하며 수계환경 중 미생물의 질을 개선하기 위한 지속적인 노로바이러스의 모니터링이 요구된다.

• Animal Bioscience
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• 제36권9호
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• pp.1336-1349
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• 2023

Objective: The study was conducted to screen differentially expressed miRNAs in sows at early pregnancy by high-throughput sequencing and explore its mechanism of action on embryo implantation. Methods: The blood serum of pregnant and non-pregnant Landrace×Yorkshire sows were collected 14 days after artificial insemination, and exosomal miRNAs were purified for high throughput miRNA sequencing. The expression patterns of 10 differentially expressed (DE) miRNAs were validated by quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction (qRT-PCR). The qRT-PCR quantified the abundance of serum exosomal miR-192 in pregnant and control sows, and the diagnostic power was assessed by receiver operating characteristic (ROC) analysis. The target genes of DE miRNAs were predicted with bioinformatics software, and the functional and pathway enrichment analysis was performed on gene ontology and the Kyoto encyclopedia of genes and genomes terms. Furthermore, a luciferase reporter system was used to identify the target relation between miR-192 and integrin alpha 4 (ITGA4), a gene influencing embryo implantation in pigs. Finally, the expression levels of miRNAs and the target gene ITGA4 were analyzed by qRT-PCR, and western blot, with the proliferation of BeWo cells detected by cell counting kit-8 (CCK-8). Results: A total of 221 known miRNAs were detected in the libraries of the pregnant and non-pregnant sows, of which 55 were up-regulated and 67 were down-regulated in the pregnant individuals compared with the non-pregnant controls. From these, the expression patterns of 10 DE miRNAs were validated. The qRT-PCR analysis further confirmed a significantly higher expression of miR-192 in the serum exosomes extracted from pregnant sows, when compared to controls. The ROC analysis revealed that miR-192 provided excellent diagnostic accuracy for pregnancy (area under the ROC curve [AUC]=0.843; p>0.001). The dual-luciferase reporter assay indicated that miR-192 directly targeted ITGA4. The protein expression of ITGA4 was reduced in cells that overexpressed miR-192. Overexpression of miR-192 resulted in the decreased proliferation of BeWo cells and regulated the expression of cell cycle-related genes. Conclusion: Serum exosomal miR-192 could serve as a potential biomarker for early pregnancy in pigs. miR-192 targeted ITGA4 gene directly, and miR-192 can regulate cellular proliferation.

• 한국초지조사료학회지
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• 제34권1호
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• pp.60-67
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• 2014

본 연구는 조사료의 반추위 발효가 진행됨에 따른 볏짚표면에 부착된 섬유소 분해 박테리아의 군집변화와 섬유소 소화율을 비교 관측하기 위하여 볏짚의 in situ 반추 발효를 실시하였다. 그리고 부착 박테리아의 군집 변화를 측정하기 위하여 RT-PCR 기법을 이용하여 F. succinogenes. R. albus와 R. flavefaciens의 군집을 모니터링 하였다. 본 연구를 수행하기 위하여 in situ 볏짚 발효를 0. 2, 4, 8, 12, 24시간 실시하였을 때 반추위내 볏짚의 in situ 분해는 발효 시간이 진행됨에 따라 가속화되어 발효 8~12시간 사이에 최고 분해 속도를 나타내었으나, F. succinogenes, R. flavefaciens과 R. albus는 모두 발효 0~1시간 사이에 볏짚 표면에 부착이 80% 이상 완료되어 이후 발효가 계속 진행되는 동안 일정 수준의 군락을 유지하는 것이 발견되었다. 그리고 반추위내 유입된 조사료의 표면에 초기 부착과정을 관찰하기 위하여 0, 5, 10, 30 및 60분 간격으로 볏짚의 in situ 샘플을 채취하여 조사하였을 때 F. succinogenes, R. flavefaciens 및 R. albus의 군락 모두 볏짚이 반추위 유입 후 5분 내에 상당량의 수가 부착함을 발견하였다. 또한 조사료의 반추위 발효 용이성에 따른 섬유소 분해 박테리아의 부착 정도를 관찰하기 위하여 0, 2, 4 및 8% NaOH를 처리한 볏짚을 12 및 24시간 in situ 배양 볏짚의 소화율과 부착 박테리아의 군집 변화를 관측하였을 때, 볏짚의 NaOH 처리 농도가 높아짐에 따라 in situ 소화율이 증가하였으며, 동시에 부착된 박테리아 군집의 증가 경향이 F. succinogenes, R. flavefaciens 및 R. albus의 3균주 모두 배양 12시간에 나타났으나 배양 24시간에서는 각기 다른 양상을 나타냈다. 따라서 본 연구결과는 반추위내 섬유소 발효과정에서 섬유소 분해 박테리아의 부착은 조사료의 반추위 유입 초기에 반드시 이루어지고, 발효 시간이 진행됨에 따라 조사료 표면에 안정된 군락을 형성하며, 섬유소 분해가 가속화된다는 사실을 보여 주었다.

• 대한의생명과학회지
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• 제29권2호
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• pp.81-87
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• 2023

Pan-Enterovirus (Pan-EV) infects millions of children and infants worldwide every year. As severe infections have recently been reported, the need for monitoring has consequently intensified. Pan-EV is a categorical name for waterborne enteroviruses belonging to the Picornaviridae family, and includes a wide range of pathogens including Coxsackievirus (CoxV), Echovirus (EcoV) and Enterovirus (EV). In this study, we proposed an optimal RT-nested PCR method for diagnosis of various types of Pan-EV in an aquatic environment and developed a positive control. Considering detection sensitivity, specific reaction, and final identification, one condition capable of amplifying 478 bp among the four candidates in the 1^st round PCR (RT-PCR) and one condition in the 2^nd round PCR (nested PCR) were selected. Through the detection of nucleic acids extracted from 123 groundwater samples and the detection sensitivity test based on artificial spiking in the sample, the methods are optimal for non-disinfected water samples such as groundwater. We developed a positive control for Pan-EV detection that can be amplified to different sizes under the two conditions. Accuracy could be further improved by testing for contamination from the control group. The method proposed in this study and the positive control developed are expected to be used in monitoring Pan-EV in aquatic environments including groundwater through future research using more samples.

• 한국군사과학기술학회지
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• 제22권4호
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• pp.575-580
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• 2019

In biological warfare, it is important to identify biological agents for proper treatment. We focused on developing a real-time RT-PCR kit that can detect multiple species of biological agents. AccuPower(R) Biothreat Real-Time RT-PCR Kit(v3.0) could detect Bacillus anthracis, Yersinia pestis, Vibrio cholerae, Francisella tularensis, Salmonella typhi, Rickettsia prowazekii, Variola virus, Hantaan virus, Yellow fever virus, Brucella spp., Shigella dysenteriae in a single reaction. The results showed that the kit was verified to be able to detect at least 0.005 ng of nucleotide and 10,000 CFU/ml of bacteria. Therefore, the kit is expected to be used as a rapid and sensitive detection kit for 11 species of biological agents within 2 hours.