토양에 존재하는 다핵방향족탄화수소(Polycyclic Aromatic Hydrocarbons, PAHs)의 처리를 위하여 자연계로부터 분리된 균주는 Pseudomonas sp.로 동정되었으며, 이 균주를 KM1으로 명명하였다. 균주의 최적 성장조건은 회분식 배양에서 $35^{\circ}C$, pH 7로 나타났다. 분리균주 Pseudomonas sp. KM1에 의한 7-PAHs(naphthalene, acenaphthylene, acenaphthene, fluorene, phenanthrene, fluoranthene and pyrene)의 분해실험결과 배양 1일 만에 fluoranthene을 제외한 naphthalene, acenaphthylene, acenaphthene, fluorene, phenanthrene and pyrene 이 분해됨을 확인할 수 있었다. 그리고 토양유무에 따른 PAHs 분해실험 결과, 흡착분배계수와 유기물함량(%)이 큰 신동방이 경방이나 봉동보다 분리균주에 의한 생분해율(%)이 낮았다. 토양에 오염된 유기화합물의 분배특성과 토양 내 유기물함량(%)이 오염된 토양의 생물학적 처리효과에 영향을 미치는 중요한 인자인 것으로 나타났다.
한국의 남해안에서 한천 분해능이 뛰어난 해양 미 생물을 분리하여 통정한 결과 Pseudomonas 속으로 판명되었으며, 본 연구에서는 이 균을 Halophilic P Pseudomonas sp. W7이라 명영하였다. 이 균주는 호염성 세균으로, 한천의 존재 하에서 높은 효소활성 을 가지는 extracellular agarase를 생산해 내었다. 이 extracellular agarase를 DEAE-Cellulose ani- on exchange chromatography와 gel filtration을 통해 정제하였으며, 정제된 agarase는 SDS-PAGE 를 통해 약 89KDa의 분자량을 지니는 single protein band염을 확인하였다. 한편 agarase의 대량생 산을 위하여 host cell Eo coli JM83과 vector pUC19를 이용하여 gene cloning을 행하였다. Pseudomonas sp. W7의 chromosomal DNA가 삽 입 된 균주 중에 서 agarase activity를 나타내는 E. coli JM83/pSWl과 Eo coli JM83/pSW3를 선멸하 였으며, 전기영통 실험결과 이들은 각각 307Kb, 3.0 K Kb의 chromosomal 단편을 지니고 있음을 확인하였 다. 또한 agarase 유전자가 압입된 변이 균주(B)는 inclusion body 형태의 interacellular agarase를 세포 내에 축적하고 있음이 확인되었다.
사과탄저병균, Glomerella cingulata에 선택적으로 항균활성이 있는 세균을 분리한 후 형태 및 생리화학적인 특성을 기준으로 동정하여 Pseudomonas sp. DGUM 5051로 명명하였다. 분리균의 생장을 위한 최적 pH와 온도는 각각 6.0과 $30^{\circ}C$이었고, 최적 항균활성을 나타내는 pH와 온도는 각각 7.0와 $24^{\circ}C$이었다. 사용한 복합배지 중 생장 및 항균활성에 있어서는 Brucella, Brain heart infusion과 LB배지가 우수하였다. Mineral salts 배지에 유일 탄소원, 질소원 및 인산원으로 각각 Sucrose, $KNO_3$ 및 $K_2HPO_4$를 첨가하였을 때 우수한 항균활성을 나타내었다. Pseudomonas sp. DGUM 5061의 항균활성은 배양 12시간 경과 후에 나타났다.
본 연구에서는 중금속, 특히 은(銀)을 축적하는 세균을 지하수로부터 분리, 동정하고, 분리 균주의 특성 및 중금속 축적조건을 규명하여 최대축적이 일어날 수 있는 조건을 검토하였다. 서울시 지하수 10개 정점으로부터 분리된 은(銀) 축적 세균 중 가장 축적능이 뛰어난 두 균주를 선별하였으며 이들은 Pseudomonas fluorescens와 Bacillus cereus로 동정되었다. 본 분리 균주는 은(銀)의 농도가 5 ppm, 10 ppm, 20 ppm으로 높아질수록 생장 저해를 심하게 받았다. pH가 낮을수록 세포의 성장이 저하되기는 하였지만 세포 당 은(銀) 축적율은 오히려 증가하였으며 24시간 이내에 최대축적이 이루어졌다. 이때 은(銀) 축적량은 Pseudomonas fluorescens의 경우 약 1.9 $mg/g{\cdot}cell$ 이었으며 Bacillus cereus는 약 1.65 $mg/g{\cdot}cell$ 이었다. 은(銀) 처리시, Bacillus cereus에서 126 KDa, 89 KDa, 25 KDa 등 3개의 단백질이 특이적으로 증가하였으며, Pseudomonas fluorescens에서는 101 KDa, 68 KDa, 27 KDa 크기의 단백질이 감소하였으나 34 KDa 크기의 새로운 단백질이 유도됨을 확인하였다.
본 연구에서는 p-cresol 초기 분해에 관여하는 기존의 lap과 pcu 유전자군 외에 새로운 pch 유전자군을 Pseudomonas alkylphenolica KL28로 부터 동정하였다. 이 유전자군(pchACXF-pcaHG-orf4-pcaBC)은 p-cresol을 ${\beta}$-carboxy-cis,cis-muconate로의 전환을 촉매할 수 있는 효소를 암호화하는 것을 알 수 있었다. 이 유전자 군은 영국에서 분리된 Pseudomonas putida NCIMB 9866과 9869의 plasmid에서 유래된 pch 유전자 군과 동일하여, 이들 유전자군은 종간 horizontal gene transfer로 전달되었을 가능성을 제시하였다. 각 유전자군의 관련 유전자의 변이와 gfp 레포터를 갖는 프로모터의 발현 분석을 통해 3개의 분해 유전자군이 모두 p-cresol의 분해에 관여하는 것을 알 수 있었으며, pch 유전자는 p-cresol에 의해 유도되며, 고체 및 액체 배지에서도 pcu 유전자군이 가장 높게 발현되는 것을 확인할 수 있었다. 또한 pcu 유전자 변이주는 p-cresol을 이용하여 버섯모양의 공중체(aerial structure) 형성하지 않았으므로, 탄소원의 이용 속도가 다세포 구조 형성에 영향을 주는 중요한 요소 중의 하나임을 알 수 있었다.
염 스트레스를 비롯한 다양한 비생물학적 스트레스는 식물의 생장저해와 작물 생산량을 감소시키는 요인으로 작용한다. 계화도 간척지 토양에서 식물생장 촉진 세균을 분리하여 Pseudomonas sp. G19로 명명하였다. G19 균주는 36시간 배양 후 $7.5{\mu}g/ml$의 indole acetic acid를 생산하고 불용성인산을 25% 가용화시켰으며, 식물의 에틸렌 감소와 관련된 1-aminocyclopropane-1-carboxylate deaminase를 발현하였다. 또한 150 mM NaCl에 침지된 염 조건의 토양에서 재배된 유묘기 배추를 이용한 실증실험에서 G19 균주는 배추의 생체중량을 증가시킴으로써 염 스트레스의 경감 및 생장 촉진에 관여함을 알 수 있었다.
화합물을 분해하는 우수균주 개발의 기초연구로서, 대전 근교 지역의 논과 밭에서 채취한 토양 표품으로부터 100균주의 세균을 분리하였고, 그 중 2,4,5-T를 단일 탄소원으로 하는 고체 최소 배지에서 잘 자라는 균주 19균주를 선별하였다. 이들 균주를 등정한 결과 Pseudomonas속이 11균주 Acinetobacter속이 4균주, Alcaligenes속이 1균주이고 3균주는 미동정되었다. Pseudomonas속으로 밝혀진 MU19와 MU92는 네가지 염소계 화합물들(2,4-D, 2,4,5-T, MCPA 그리고 3CB)을 모두 분해하는 것으로 나타났다. 최소 액체배지에서 배양한 경우 Acinetobacter로 동정된 MU38균주가 접종 48시간 후에 가장 높은 분해도를 나타내었고, MUl9, MU57, MU73과 MU92는 그 다음으로 높은 분해도를 나타냈다. 실험결과 선별된 19균주 중 Acinetobacter sp. MU38 그리고 Pseudomonas sp. MU19과 MU92는 염소계 방향쪽 화합물에 대한 넓은 분해능을 갖고 있으며, 특히 2,4,5-T에 대한 높은 분해도를 나타내는 것으로 조사되었다.
4-Chlorobiphebyl(4CB)를 분해한 Pseudomonas sp. DJ-12가 가지고 있는 pcbABCD 유전자를 Escherichia coli에 클로닝한 결과, 재조합 균주인 E. coli CU1과 CU101은 모두 Pseudomonas sp. DJ-12에서와 같이 4CB를 분해하여 2,3-dihydrozybiphenyl(2,3-DHBP)을 생성하는 탈염소화 기능을 보여주었다. 특히 pcbAB를 포함하는 재조합 플라스미드인 pCU101을 가지고 있는 E. coli CU101은 Pserudomonas sp. DJ-12에서와 같이 4CB로부터 4-chlorobenzoic acid를 생성하지 않고 2, 3-DHBP만을 생성하는 탈염소화 기능을 보여주었다. 그러므로 Pseudomonas sp. DJ-12의 염색체 DNA로부터 클로닝한 약 2.2kb의 pcbAB 유전자는 4CB로부터 2,3-DHBP만을 생성하는 탈염소화기능을 가지고 있음이 밝혀졌다.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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