• 한국미생물·생명공학회지
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• 제18권6호
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• pp.553-559
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• 1990

많은 관심이 집중되고 있는 환경오염의 대처방안의 일환으로, plastic 및 wrap 제조시 가소제로 가장 널리 사용되고 폐수 중에 대량 유출되어 인체에 유독한 난분해성 고분자 유기합성 물질로서 문제가 되고 있는 phthalate ester의 일종인 dibutyl phthalate(DBP)를 분해 자화할 수 있는 미생물을 분리하고자 했다. 저자들은 대구 근교의 토양 및 sludge에서 DBP 분해 관련 효소인 protocatechuate dioxygenase을 생성하는 새로운 균주를 분리하여 동정하였다.

• Journal of Microbiology
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• 제37권3호
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• pp.123-127
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• 1999

A Pseudomonas sp. strain DJ-12 isolated by 4-cholrobiphenyl enrichment culture technique is capable of utilizing 4-hydroxybenzoic acid as a sole source of carbon and energy. The bacterium catabolized 4-hydroxybenzoic acid through the intermediate formation of protocatechuic acid, which was further metabolized. The cell free extracts of pseudomonas sp. DJ-12, grown on 4-hydroxybenzoic acid showed higher activities of 4-hydroxyenzoate 3-hydroxylase and protocatechuate 4,5-dioxygenase, but the activity of catechnol 2,3-dioxygenase was lower. The results suggest that 4-hydroxybenzoic acid is catabolized via protocatechuic acid rather than catechol or gentisic acid in this bacterium and that the protocatechuic acid formed was metabolized through a metacleavage pathway by protocatechuate 4,5-dioxygenase.

• Journal of Microbiology and Biotechnology
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• 제16권12호
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• pp.1995-1999
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• 2006

Pseudomonas sp. K82 cultured in p-hydroxybenzoate induces protocatechuate 4,5-dioxygenase (PCD 4,5) for p-hydroxybenzoate degradation. In this study, a 6.0-kbp EcoR1 fragment containing p-hydroxybenzoate degradation genes was cloned from the genome of Pseudomonas sp. K82. Sequence analysis identified four genes, namely, pcaD, pcaA, pcaB, and pcaC genes known to be involved in p-hydroxybenzoate degradation. Two putative 4-hydroxyphenylpyruvate dioxygenases and one putative oxidoreductase were closely located by the p-hydroxybenzoate degradation genes. The gene arrangement and sequences of these p-hydroxybenzoate degradation genes were similar to those of Comamonas testosteroni and Pseudomonas ochraceae. PcaAB (PCD4,5) was overexpressed in the expression vector pGEX-4T-3, purified using a GST column, and confirmed to have protocatechuate 4,5-dioxygenase activity. The N-terminal amino acid sequences of overexpressed PCD4,5 were identical with those of purified PCD4,5 from Pseudomonas sp. K82.

• Journal of Microbiology and Biotechnology
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• 제24권4호
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• pp.475-482
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• 2014

The metabolic pathway of eugenol degradation by thermophilic Geobacillus sp. AY 946034 strain was analyzed based on the lack of data about eugenol degradation by thermophiles. TLC, GC-MS, and biotransformation with resting cells showed that eugenol was oxidized through coniferyl alcohol, and ferulic and vanillic acids to protocatechuic acid before the aromatic ring was cleaved. The cell-free extract of Geobacillus sp. AY 946034 strain grown on eugenol showed a high activity of eugenol hydroxylase, feruloyl-CoA synthetase, vanillate-O-demethylase, and protocatechuate 3,4-dioxygenase. The key enzyme, protocatechuate 3,4-dioxygenase, which plays a crucial role in the degradation of various aromatic compounds, was purified 135-fold to homogeneity with a 34% overall recovery from Geobacillus sp. AY 946034. The relative molecular mass of the native enzyme was about $450{\pm}10$ kDa and was composed of the non-identical subunits. The pH and temperature optima for enzyme activity were 8 and $60^{\circ}C$, respectively. The half-life of protocatechuate 3,4-dioxygenase at the optimum temperature was 50 min.

• Journal of Microbiology
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• 제42권2호
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• pp.152-155
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• 2004

Pseudomonas sp. K82 has been reported to be an aniline-assimilating soil bacterium. However, this strain can use not only aniline as a sole carbon and energy source, but can also utilize benzoate, p-hydroxybenzoate, and aniline analogues. The strain accomplishes this metabolic diversity by using dif-ferent aerobic pathways. Pseudomonas sp. K82, when cultured in p-hydroxybenzoate, showed extradiol cleavage activity of protocatechuate. In accordance with those findings, our study attempted the puri-fication of protocatechuate 4,5-dioxygenase (PCD 4,5). However the purified PCD 4,5 was found to be very unstable during purification. After Q-sepharose chromatography was performed, the crude enzyme activity was augmented by a factor of approximately 4.7. From the Q-sepharose fraction which exhibited PCD 4,5 activity, two subunits of PCD4,5 (${\alpha}$ subunit and ${\beta}$ subunit) were identified using the N-terminal amino acid sequences of 15 amino acid residues. These subunits were found to have more than 90％ sequence homology with PmdA and PmdB of Comamonas testosteroni. The molecular weight of the native enzyme was estimated to be approximately 54 kDa, suggesting that PCD4,5 exists as a het-erodimer (${\alpha}$$_1$${\beta}$$_1$). PCD 4,5 exhibits stringent substrate specificity for protocatechuate and its optimal activity occurs at pH 9 and 15 $^{\circ}C$. PCR amplification of these two subunits of PCD4,5 revealed that the ${\alpha}$ subunit and ${\beta}$ subunit occurred in tandem. Our results suggest that Pseudomonas sp. K82 induced PCD 4,5 for the purpose of p-hydroxybenzoate degradation.

• KSBB Journal
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• 제19권1호
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• pp.50-56
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• 2004

본 연구의 목적은 방향족 화한물인 aniline, benzoate, p-hydroxybenzoate를 분해할 수 있는 Delftia sp. JK-2에서 이들 각 기질에서 배양시 다른 종류의 dioxygenases를 분리 정제하고, 정제된 dioxygenases의 특성을 조사하기 위하여 실시하기 위한 것이다. 기질로서 benzoate, aniline, 또는 p-hydroxybenzoate에 따라 분리된 dioxygenases는 각각 catechol 1,2-dioxygenase (C1 ,2O), catechol 2,3-dioxygenase(C2, 3O), 그리고 protocatechuate 4,5-dioxygenase (4,5-PCD)였다. 각 dioxygenases의 특성을 조사하기 위하여 먼저 benzoate, aniline 또는 p-hydroxybenzoate에서 배양한 Delftia sp. JK-2 세포를 초음파 분쇄기로 파쇄하여, ammonium sulfate precipitation, DEAE-sepharose, 그리고 Q-sepharose의 순서로 정제하여 농축하였다. 정제$.$농축된 dioxygenases의 특이 활성도를 보면 C1, 2O는 3.3 unit/mg, C2, 3O는 4.7unit/mg이고, 4,5-PCD는 2.0 unit/mg이다 C1, 2O와 C2, 3O의 기질 특이성 조사에서는 catechol과 4-methylcatechol에서 두 효소 모두 효소 활성이 나타났으며, C1. 2O에서는 3-methylcatechol에서 약간의 활성이 확인되었고, 4,5-PCD는 protocatechuate에서만 효소 활성을 보여주었다. C1l, 2O와 C2, 3O는 3$0^{\circ}C$와 pH 8.0에서 최적의 활성을 나타내는 것으로 조사되었으며, 4,5-PCD는 3$0^{\circ}C$와 pH 7.0에서 최적의 활성이 조사되었다. Delftia sp. JK-2에서 정제된 C1, 2O와 C2, 3O의 효소활성은 Ag$^{+}$, Hg$^{+}$, 그리고 Cu$^{2+}$에 의해 억제되는 것으로 나타났으며, 4,5-PCD의 경우에는 Ag$^{+}$, Hg$^{+}$, 그리고 Cu$^{2+}$ 뿐만 아니라 Fe$^{3+}$ 에 이해서도 효소 활성이 억제되는 것이 확인되었다. C1, 2O, C2, 3O, 4,5-PCD의 분자량은 SDS-PAGE에 의해 각각 60kDa, 35kDa, 62kDa로 측정되었다.

• 생명과학회지
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• 제25권5호
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• pp.487-495
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• 2015

Pseudomonas pseudoalcaligenes KF707에서 정제한 protocatechuate 3,4-dioxygenase의 특징을 조사하기 위하여 pH안정성, 화학적 저해, 화학적 수식과 pH의존성 반응 상수에 대한 실험을 수행하였다. 이 효소는 pH 4.5~10.7에서 안정하였다. L-ascorbate와 glutathione은 Kis가 각각 0.17 mM과 0.86 mM인 경쟁적 저해제였으며, DL-dithiothreitol은 Kis 1.57 mM 및 Kii 8.08 mM의 비경쟁적 저해패턴을 나타내었다. Potassium cyanide, p-hydroxybenzoate 및 sodium azide는 Kis가 각각 55.7 mM, 0.22 mM 및15.64 mM이었으며, Kii는 각각94.1 mM, 8.08 mM, 및 662.64 mM인 비경쟁적 저해패턴을 나타내었다. $FeCl_{2}$는 Kis가 $29{\mu}M$로 가장 우수한 경쟁적 저해제였으며, $FeCl_{3}$, $MnCl_{2}$, $CoCl_{2}$, $HgCl_{2}$, $AlCl_{3}$도 각각 Kis가 1.21 mM, 0.85 mM, 3.98 mM, 0.17 mM 및 0.21 mM인 경쟁적 저해패턴을 보였다. 한편, 다른 금속이온들은 비경쟁적 저해패턴을 나타내었다. pH의존성 반응상수의 실험결과로부터 pK 6.2와 9.4의 촉매부위와 pK 5.5와 9.0의 결합부위가 존재함을 알 수 있었다. Lysine, cysteine, tyrosine, carboxyl과 histidine은 각각의 고유한 화학적 수식제에 의해 수식되었는데, 이는 이들 잔기들이 결합과 촉매에 관여한다는 것을 나타낸다. 위 결과를 토대로 화학적 메커니즘을 제시한다.

• 미생물학회지
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• 제41권3호
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• pp.195-200
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• 2005

Comamonas sp. strain DJ-12의 pmcABCDEFT 유전자군은 protocatechuate (PCA)의 분해과정에 관여하는 PCA 4,5-dioxygenase, 4-carboxy-2hydroxymuconic semialdehyde (CHMS) dehydrogenase, 2-pyrone04,5-dicarboxylate(PDC) hydrolase, 4-oxalomesaconate (OMA) hydratase, 그리고 4-oxalocitramalate (OCM) aldolase 등의 효소들을 생산하는 유전자들과 transporter의 역학을 하는 유전자로 각각 확인되었다. 이 유전자군은 Comamonas sp. strain DJ-12의 chromosomal DNA로부터 얻은 PCR 산물들을 T-vector에 ligation하여 재조합 플라스미드 pMT1, pMT2, pMT3, pMT4, pMT5, pMT6, pMT7, pMT8, pMT9, pMT10을 제조하였다. 이들 재조합 플라스미드의 염기서열을 분석한 결과 PCA 4,5-dioxygenase 유전자는 alpha(pmcA)와 beta(pmcB) 두 개의 subunit으로 구성 되어있으며, 각각 450 bp와 870 bp이었다. CHMS dehydrogenase 유전자(pmcC)는 960 bp, PDC hydrolase 유전자(pmcD)는 918 bp이였으며, OMA hydratase 유전자(pmcE)는 1029 bp, OCM aldolase 유전자 (pmcF)는 689 bp, 그리고 transporter 유전자(pmcT)는 1,398 bp이였다. 이들 pmc 유전자들은 pmcT-pmcE-pmcF-pmcD-pmcA-pmcB-pmcC의 순서로 배열되어 있었다. Comamonas sp. strain DJ-12의 pmcABCDEFT 유전자산물의 아미노산 서열을 분석한 결과, Comamonas testosteroni BR6020 및 Psedomonas ochraceae NG.J1와 $94{\~}98\%$의 높은 유사성을 보였고, 그 유전자들의 배열 순서도 동일하였다. 그러나 Sphingomonas paucimobilis SYK-6, Sphingomonas sp. LB126, 그리고 Arthrobacter keyser 12B와는 아미노산 서열이 $52{\~}74\%$의 유사성을 보였고, 그 유전자의 배열 구조도 상이하였다.

• Journal of Microbiology
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• 제44권6호
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• pp.632-640
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• 2006

In this study, the biodegradative activities of monocyclic aromatic compounds were determined from the multi-drug resistant (MDR) Acinetobacter baumannii, which were studied in the form of clinical isolates from a hospital in Korea. These bacteria were capable of biodegrading monocyclic aromatic compounds, such as benzoate and p-hydroxybenzoate. In order to determine which pathways are available for biodegradation in these stains, we conducted proteome analyses of benzoate, and p-hydroxybenzoate-cultured A. baumannii DU202, using 2-DE/MS analysis. As genome DB of A. baumannii was not yet available, MS/MS analysis or de novo sequencing methods were employed in the identification of induced proteins. Benzoate branch enzymes [catechol 1,2-dioxygenase (CatA) and benzoate dioxygenase $\alpha$ subunit (BenA)] of the $\beta$-ketoadipate pathway were identified under benzoate culture condition and p-hydroxybenzoate branch enzymes [protocatechuate 3,4-dioxygenas $\alpha$ subunit (PcaG) and 3-carboxy-cis,cis-muconate cycloisomerase (PcaR)] of the $\beta$-ketoadipate pathway were identified under p-hydroxybenzoate culture condition, respectively, thereby suggesting that strain DU202 utilized the $\beta$-ketoadipate pathway for the biodegradation of monocyclic aromatic compounds. The sequence analysis of two purified dioxygenases (CatA and PcaGH) indicated that CatA is closely associated with the CatA of Acinetobacter radiresistance, but PcaGH is only moderately associated with the PcaGH of Acinetobacter sp. ADPI. Interestingly, the fused form of PcaD and PcaC, carboxymuconolactone decarboxylase (PcaCD), was detected on benzoate-cultured A. baumannii DU202. These results indicate that A. baumannii DU202 exploits a different $\beta$-ketoadipate pathway from other Acinetobacter species.

• Journal of the Korean Wood Science and Technology
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• 제25권2호
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• pp.1-20
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• 1997

목재를 분해시키는 담자균류들은 목재 및 목질복합체에 쉽사리 침투하여 복잡한 리그노셀룰로오스 복합체를 분해시킨다. 이러한 분해에는 많은 효소시스템들이 복합적으로 작용하면서 상호 협동하는 것으로 보고되고 있다. 지금까지 일려진 효소들은 통상 3개의 그룹으로 나눌 수 있는데 그 하나는 목재성분을 직접적으로 공격하는 효소균들, 예를 들면 cellulase complex, laccase(LAC), lignin peroxidase(LIP), horse-radish peroxidase(HRP), manganese-independent peroxidase(MIP) 및 protocatechuate 3,4-dioxygenase(PCD) 등이 있고, 두번째 그룹으로서 manganese-dependent peroxidase(MnP), aryl alcohol oxidase(AAO) 및 glyoxal oxidase(GLO) 등인데, 이들 효소들은 목질을 직접적으로 공격하지 않고 제1그룹의 효소들과 협동하여 작용하는 것으로 알려지고 있다. 제3그룹의 효소들은 glucose oxidase(GOD) 및 cellobiose : quinone oxidoreductase(CBQ)로서 feedback type의 효소들로서 목재고분자의 분해시 대사의 고리를 결합시켜 주는 매우 중요한 기능을 하는 효소군들이다. 그러나 이 이외에도 다른 분해기구가 밝혀지고 있으며 기타 효소들에 의한 리그노셀룰로오스의 분해반응기구의 해명에는 상당한 시간이 걸릴 것으로 사료된다.