초록
본 연구의 목적은 방향족 화한물인 aniline, benzoate, p-hydroxybenzoate를 분해할 수 있는 Delftia sp. JK-2에서 이들 각 기질에서 배양시 다른 종류의 dioxygenases를 분리 정제하고, 정제된 dioxygenases의 특성을 조사하기 위하여 실시하기 위한 것이다. 기질로서 benzoate, aniline, 또는 p-hydroxybenzoate에 따라 분리된 dioxygenases는 각각 catechol 1,2-dioxygenase (C1 ,2O), catechol 2,3-dioxygenase(C2, 3O), 그리고 protocatechuate 4,5-dioxygenase (4,5-PCD)였다. 각 dioxygenases의 특성을 조사하기 위하여 먼저 benzoate, aniline 또는 p-hydroxybenzoate에서 배양한 Delftia sp. JK-2 세포를 초음파 분쇄기로 파쇄하여, ammonium sulfate precipitation, DEAE-sepharose, 그리고 Q-sepharose의 순서로 정제하여 농축하였다. 정제$.$농축된 dioxygenases의 특이 활성도를 보면 C1, 2O는 3.3 unit/mg, C2, 3O는 4.7unit/mg이고, 4,5-PCD는 2.0 unit/mg이다 C1, 2O와 C2, 3O의 기질 특이성 조사에서는 catechol과 4-methylcatechol에서 두 효소 모두 효소 활성이 나타났으며, C1. 2O에서는 3-methylcatechol에서 약간의 활성이 확인되었고, 4,5-PCD는 protocatechuate에서만 효소 활성을 보여주었다. C1l, 2O와 C2, 3O는 3$0^{\circ}C$와 pH 8.0에서 최적의 활성을 나타내는 것으로 조사되었으며, 4,5-PCD는 3$0^{\circ}C$와 pH 7.0에서 최적의 활성이 조사되었다. Delftia sp. JK-2에서 정제된 C1, 2O와 C2, 3O의 효소활성은 Ag$^{+}$, Hg$^{+}$, 그리고 Cu$^{2+}$에 의해 억제되는 것으로 나타났으며, 4,5-PCD의 경우에는 Ag$^{+}$, Hg$^{+}$, 그리고 Cu$^{2+}$ 뿐만 아니라 Fe$^{3+}$ 에 이해서도 효소 활성이 억제되는 것이 확인되었다. C1, 2O, C2, 3O, 4,5-PCD의 분자량은 SDS-PAGE에 의해 각각 60kDa, 35kDa, 62kDa로 측정되었다.
The aim of this work was to investigate the purification and characterization dixoygenases isolated from Delftia sp. JK-2, which could utilize aniline, benzoate, and p-hydroxybenoate as sole carbon and energy source. Catechol 1,2-dioxygenase (C1, 2O), catechol 2,3-dioxygenase(C2, 3O), and protocatechuate 4,5-dioxygenase(4,5-PCD) were isolated by benzoate, aniline, and p-hydroxybenzoate. In initial experiments, several characteristics of C1 ,2O, C2, 3O, and 4,5-PCD separated with ammonium sulfate precipitation, DEAE-sepharose, and Q-sepharose were investigated. Specific activity of C1 ,2O, C2, 3O, and 4,5-PCD were approximately 3.3 unit/mg, 4.7 unit/mg, and 2.0 unit/mg. C1 ,2O and C2, 3O demonstrated their enzyme activities to other substrates, catechol and 4-methylcatechol. 4,5-PCD showed the specific activity to the only substrate, protocatechuate, but the substrates(e.g., catechol, 3-methylcatechol, 4-methylcatechol, 4-chlorocatechol, 4-nitrocatechol) did not show any specific activities in this work. The optimum temperature of C1, 2O, C2, 3O, and 4,5-PCD were 30$^{\circ}C$, and the optimal pHs were approximately 8, 8, and 7, respectively. Ag$\^$+/, Hg$\^$+/, Cu$\^$2+/ showed inhibitory effect on the activity of C1, 2O and C2, 3O, but Ag$\^$+/, Hg$\^$+/, Cu$\^$2+/, Fe$\^$3+/ showed inhibitory effect on the activity of 4,5-PCD. Molecular weight of the C1, 2O, C2, 3O, and 4,5-PCD were determined to approximately 60 kDa,35 kDa, and 62 kDa by SDS-PAGE.