• KSBB Journal
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• 제25권2호
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• pp.142-154
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• 2010

Inonotus obliquus 균사체의 액상배양을 통한 항당뇨효능의 단백다당체 대량생산 배양공정을 개발하기 위한 첫 단계로 고생산성 균주의 개발을 신속하게 수행하기 위한 방법을 개발하였다. I. obliquus는 균사체로 성장할 때 포자를 형성하지 못하므로 단일 세포를 획득하기 위해서는 원형질체들을 회수하여 이로부터 성장 능력과 단백다당체의 생산성이 높은 우량균주를 선별하여야 한다. 본 연구에서는 이러한 균주개량 공정 중 특별히 장기간의 배양 시간이 요구되어 신속한 균주개발 시 가장 큰 장애 요인으로 작용하는 고체성장배양 단계의 문제점을 극복하고자, 고체배양 환경의 최적화에 대한 연구를 중점적으로 수행하였다. 고체성장배양 시 균사체 성장에 효능이 탁월한 배지성분을 선별하기 위해 우선 Plackett-Burman design 실험을 통해서 유의성 높은 배지성분을 찾아내었고, 이에 근거한 부분요인설계법 fractional factorial design, FFD) 실험을 통해 배지성분 상호간의 관계를 분석 할 수 있었다. 또한 이 FFD 실험결과에 근거해서 설계한 최급상승법 (steepest ascent method, SAM) 실험방법을 적용한 결과, 고체성장배양 시 균사체 성장환의 직경이 기존의 MA 배지와 비교해서 약 41% 증가했을 뿐만 아니라 균사체의 밀도도 크게 향상된 배지조성을 확립 할 수 있었다. 또한 SAM 연구결과를 바탕으로 최적의 배지조성을 확립하고자 각 배지성분의 최적농도를 통계적으로 더욱 정밀하게 조사하는 반응표면분석법 (response surface method, RSM) 실험을 수행하였다. 그 결과 최적고체성장배지의 성분과 농도는 glucose 25.61 g/L, brown rice 12.53 g/L, soytone peptone 12.53 g/L, $MgSO_4$ 5.53 g/L, agar 20 g/L인 것으로 최종 결정되었으며, 이 조건에서 13일 동안 배양시 균사체의 직경이 약 82 mm 정도에 이르는 것으로 나타났다. 이 결과는 상기의 SAM 실험에서 최적농도로 제시한 배지조성과 매우 유사한 것으로 확인되었는데, 이로부터 최종적인 RSM 실험을 수행하기 전에 최적 농도의 근사치를 추정하기 위해서 수행한 SAM 실험이 매우 효율적이었음을 확인할 수 있었다. 또한 배지 최적화 결과 고체성장배양에서의 성장속도의 증가로 인해 배양기간을 기존의 15~20일에서 8일로 획기적으로 줄일 수 있게 되어, 짧은 시간 내에 대규모 균주 선별과 각 균주의 단백다당체의 생산성 확인이 가능하게 되었다.

• KSBB Journal
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• 제20권5호
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• pp.376-382
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• 2005

AVM $B_{1a}$는 Streptomyces avermitilis가 생합성하는 이차대사산물로, 강력한 구충효과를 갖는 polyketide 계열의 물질이다. AVM $B_{1a}$ 생합성의 전구체로 isoleucine이 사용되고 AVM의 생합성 경로가 지방산 합성과 유사하므로, 전구체를 과량생합성하고 polyketide 생합성 경로로 진행되는 탄소원의 흐름이 증가된 변이주를 선별하기 위하여 isoleucine의 아미노산 유사체 (O-methyl threonine)와 지방산 합성 저해물질 (p-fluoro phenoxy acetic acid)에 대한 저항성 변이주를 선별하고자 하였다. 모균주의 AVM $B_{1a}$ 생산성은 약 100 units/L로 매우 낮은 반면, 100 ppm의 pFAC에 대한 저항성 변이주인 PFA-1는 약 4,200 units/1의 AVM $B_{1a}$를 생산하는 것으로 관찰되었다. 이 균주를 모균주로 하여 OMT에 대한 저항성을 지속적으로 증가시킬 경우 AVM $B_{1a}$ 생산성이 2배 더 증가한 약 9,000 units/1의 생합성 능력을 보이는 고생산성 변이주를 개발할 수 있었다. 또한 주목할 만하게도 지방산 저해물질인 PFAC에 대한 변이주의 저항성을 지속적으로 증가시킴으로써 AVM $B_{1a}$ 생산성이 11,000 units/L에 이르는 고역가 변이주를 선별할 수 있었다. 한편 상기의 OMT와 pFAC를 이용한 rational screening 전략을 통해 지속적으로 선별한 변이주들에 대한 AVM $B_{1a}$의 생산성 분포를 histogram을 통해 분석해 본 결과, 초반부에 선별된 돌연변이주들은 AVM $B_{1a}$의 생합성 능력에 있어서 거의 모두가 ($95\%$ 이상) 4,000 units/1 이하의 비교적 낮은 범위에 분포하는 반면, OMT와 pFAC의 농도를 높여가며 유도된 저항성 돌연변이주들의 경우에는 이들 중에 고생산성 균주의 비율이 뚜렷하게 증가 (OMT 에서 $5,000\~7,000$ unit/l 범위에 $71\%$; pFAC에서 $6,000\~7,000$ unit/L 범위에 $47\%$) 하는 것으로 확인되었다. 이로부터 polyketide 생합성 경로와 AVM $B_{1a}$의 생합성 경로의 이해를 통해 수행된 rational screening 전략이 AVM $B_{1a}$ 고생산성 뿐만 아니라 고 안정성의 특성을 갖는 균주를 선별하는데 매우 효율적임을 알 수 있었다.

• 생명과학회지
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• 제24권11호
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• pp.1174-1179
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• 2014

본 연구는 감마선이 새로운 품종의 버섯을 개발하는데 이용 될 수 있는지 평가하기 위하여 수행하였다. 본 연구를 한국, 일본, 대만 등의 느티만가닥버섯 20종류, 한국 잿빛느티만가닥버섯 5종류, 일본 땅지만가닥버섯 등의 3품종과 돌연변이체의 유전적 변이를 분석하였다. 50~2,000 Gy의 감마선을 느티만가닥버섯 포자에 조사하였다. 포자를 이용한 돌연변이 유발의 감마선 적정선량은 50~500 Gy의 저준위선량이었다. 돌연변이 단핵균사를 교배하여 이핵균주를 만들었다. 돌연변이 균주와 재래종의 버섯들로부터 DNA를 추출하여 16S ribosomal DNA, ITS의 전부분 28S ribosomal DNA의 일부분이 포함된 ITS서열을 분석을 하였다. 분석한 ITS서열의 길이는 1,052~1,143 뉴클레오티드였다. Nei-Li's 방법에 의해 유전적 유연 관계계를 분석하였다. 느티만가닥버섯 품종들간의 비유사도는 0~3.5%였다. 또한 Neighbor-Joining (NJ)방법에 의해 계통수를 작성하였다. 그 결과 느티만가닥버섯의 품종간의 비유사도는 0~3.5%였다. 또한 23품종과 5 돌연변이 이 그룹의 ITS서열을 바탕으로 한 계통순는 12 cluster를 나타내었다. 돌연변이 균주들은 서로 다른 cluster를 형성하였다. 무작위적인 돌연변이가 발생하였음을 알 수 있었다. 이상의 연구결과들을 감마선이 버섯의 품종개량을 위한 수단이 될 수 있음을 보여주었다.

• 한국식품영양학회지
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• 제15권4호
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• pp.364-369
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• 2002

방선균은 토양 속에 다양하게 존재하는 미생물의 일종으로 그람 양성 진정세균으로 이차대사산물을 생산하는 시기와 포자 착생이 시작되는 세포분화의 시기가 밀접한 관련이 있다. S. griseus는 streptomycin을 비롯한 다양한 종류의 endopeptidase 및 exopeptidase들을 생산한다. 방선균에서의 protease 생산은 많은 경우에 이차대사산물이 형성되거나 형태분화가 유도되는 시기에 동시에 시작된다는 점에서 Pretense가 이차대사물질 생산 및 세포분화에 일정한 기능을 수행할 것이 라는 점을 시사하고 있다. 본 연구에서는 S. griseus IFO 13350에서 클로닝한 SGPD protease가 각 strain에서 형태학적으로나 생리적으로 어떠한 gene dosage 효과를 미치는지 조사하는 것이었다. sprD 유전자가 S.lividans를 숙주로 사용한 시스템에서 대량발현이 성공적으로 되는 것을 확인한 후, 본 유전자를 클로닝한 S. griseus IFO13350 균주와 이의 A-factor 결손주인 S. griseus HH1에 형질전환하였다. S. griseus HH1과 S. griseus IFO13350에서는 protease activity가 벡터만 도입된 대조군과 sprD 유전자가 들어간 형질전환체에서 큰 차이를 보이지 않았다. 또한 S. griseus IFO 13350 및 HH1 모두에서 생리학적·형태학적 분화의 차이를 발견하지 못하였다. Chymotrypsin계열의 pretense를 암호화하는 유전자만이 S. griseus에서 발현이 repression된다는 사실을 본 연구 결과를 통하여 알게 되었다. 이를 바탕으로 sprD유전자와 동일계열의 chymotrypsin 계열의 유전자들이 공통적으로 S. griseus에서 repression 되는 일반적인 기전이 있을 것으로 판단, chymotrypsin계열 유전자들의 promoter부분의 염기 상동성을 조사하였다 번역개시부위 바로 상부 유전자부터 상동성을 조사한 결과 적어도 상당부분의 염기배열이 잘 보존된 지역이 존재함을 알게 되었다. 향후 이들 발현기구의 조절기구를 연구함으로서 protease의 기능을 밝히는데 좋은 단서를 제공할 것으로 판단된다.

• Journal of Microbiology and Biotechnology
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• 제9권1호
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• pp.22-31
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• 1999

Saccharomyces fermentati and Leuconostoc mesenteroides were isolated from a traditional kimchi, and then the Leu. mesenteroides was mutated to the acid-tolerant mutant Leu. mesenteroides M-l00. In the result of growth properties in MRS broth with various pHs adjusted with HCl and acid solution (latic acid:acetic acid=1:2), an acid-tolerant mutant Leu. mesenteroides M-100 showed more increased ability for growth than its wild strain at various temperatures. The strains were used as starters for the fermentation of kimchi. The experiments were performed with classified experimental groups (Group I, control kimchi; Group II, addition of YK-19 only; Group III, addition of M-100 only; Group IV, addition of mixture of M-100 and YK-19), and their pH, total acidity, reducing sugars content, organic acid productivity, organoleptic tests, and microfloral changes were compared. As a result, in pH and acidity, the optimal ripening period of Group IV was about 13.5 days (i.e. from the 8.5 to 22 days of fermentation). This result indicates that the optimal ripening period of Group IV was about 1.5 times longer than that of Group I. Furthermore, Group IV was edible to 28 days of fermentation. In addition, high contents of succinc acid was observed in Group IV. Group IV was also highly ranked on the organoleptic test. During the fermentation of kimchi, the number of Leuconostoc sp. in group I reduced after 7 days; however, the number of Leuconostoc sp. in Group II, III, and IV decresed after 14 days of fermentation. An especially high number of Leu. sp. was observed in Group IV, and this gave better flavor of kimchi than any other during the whole fermentation period. Citric acid, tartaric acid, succinic acid, fumaric acid, and lactic acid were detected in the kimchi, and a significant increase in the concentration of lactic acid during fermentation was observed in the all experimental groups.

• Journal of Microbiology and Biotechnology
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• 제25권12호
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• pp.2125-2134
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• 2015

IrrE is a highly conserved global regulator in the Deinococcus genus and contributes to survival from high doses of UV radiation, ionizing radiation, and desiccation. Drad-IrrE and Dgob-IrrE from Deinococcus radiodurans and Deinococcus gobiensis I-0 each share 66% sequence identity. However, Dgob-IrrE showed a stronger protection phenotype against UV radiation than Drad-IrrE in the D. radiodurans irrE-deletion mutant (ΔirrE), which may be due to amino acid residues differences around the DNA-binding HTH domain. Site-directed mutagenesis was used to generate a Drad-IrrE A184S single mutant, which has been characterized and compared with the ΔirrE mutant complemented strain with Drad-irrE, designated ΔirrE-E. The effects of the A184S mutation following UV radiation and mitomycin C (MMC) shock were determined. The A184S mutant displayed significantly increased resistance to UV radiation and MMC shock. The corresponding A184 site in Dgob-IrrE was inversely mutated, generating the S131A mutant, which exhibited a loss of resistance against UV radiation, MMC shock, and desiccation. qPCR analysis revealed that critical genes in the DNA repair system, such as recA, pprA, uvrA, and ddrB, were remarkably induced after UV radiation and MMC shock in the ΔirrE-IE and A184S mutants. These data suggested that A184S improves the ability against UV radiation and MMC shock, providing new insights into the modification of IrrE. We speculated that the serine residue may determine the efficiency of DNA binding, leading to the increased expression of IrrE-dependent genes important for protection against DNA damage.

• 한국환경농학회지
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• 제21권3호
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• pp.216-222
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• 2002

항진균 세균의 특성 및 기능변화 가능성을 조사하기 위하여 버섯폐배지, 온천수, 해조류 및 삼림토양으로부터 식물병원성 진균에 대한 8종의 항진균 활성 균주를 분리하였고 감마선($^{60}Co$)을 이용하여 $LD_{95}$에서 돌연변이체를 유도하였다. Bacillus circulans K1, Burkholderia gladioli K4와 Bacillus subtilis YS1은 12 종의 식물병원성 진균에 대해 항진균 활성을 보였다. 이들 균주의 방사선감수성 조사결과 B. gladioli K4는 감마선에 대한 높은 감수성을 보였으며, $D_{10}$ 값은 0.11 kGy 였다. 감마선에 의해 유도된 K1-1004와 YS1-1009는 Botryosphaeria dothidea에 대해 항진균 활성이 증가되었다. B. subtilis YS1의 돌연변이체인 YS1-1006과 YS1-1009는 tebuconazol과 copper hydroxide에 대해 농약 저항성을 나타냈다. SAR535, SAR5108 과 SAR5l18 돌연변이체는 야생형 균주인 Streptomyces sp. SAR01에 비해 5 종의 식물병원성 진균에 대해 항진균 활성이 없었다. 연구결과, 방사선을 이용하여 다양한 기능의 돌연변이체 유도가 가능하였다. 이를 이용하여 항진균 활성 관련 유전자 연구 및 균주개량이 가능할 것으로 사료된다.

• 생명과학회지
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• 제25권2호
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• pp.121-129
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• 2015

알긴산은 미역이나 다시마 같은 갈조류의 세포벽에 존재하거나 또는 특정 박테리아들이 biofilm을 만들기 위하여 생산하는 L-${\alpha}$-guluronate 및 D-${\beta}$-mannuronate로 구성된 산성다당류이다. 전보에서 보고한 Sphingomonas sp. MJ-3의 외부 분해효소인 올리고알긴산 분해효소(oligoalginate lyase, MJ3-Oal)는 효소단백질의 N-terminal 영역에 내부 알긴산 분해효소인 polyM 분해효소의 단백질 서열과 상동성을 가지고 있었다. 본 실험에서는 MJ3-Oal이 외부 분해효소 활성뿐 만 아니라 내부 분해효소 활성도 함께 가지는 효소인지 알기 위하여 Saccharophagus degradans 2-40T 유래 올리고알긴산 분해효소인 Alg17c의 결정구조와 상동성 모델링을 행하였으며 기질과 수소결합을 할 것으로 예상되는 잔기 중 426번째 아미노산인 tyrosine을 구조가 비슷한 phenylalanine으로 돌연변이시키고 알긴산 분해양상을 wild type과 비교하였다. MJ3-Oal의 FPLC 결과를 보면 처음에는 이당류, 삼당류 등 올리고머가 증가하다가 최종적으로 단당류로 전환되었으나 Tyr426Phe 돌연변이 효소의 FPLC profile은 외부 분해활성만 나타내었다. 또한 $^1H$-NMR spectra 역시 MJ3-Oal은 polyM block 또는 polyMG block의 내부결합을 분해하는 활성을 나타내었다. 이와 같은 결과들은 Sphingomonas sp. MJ-3 유래 올리고알긴산 분해효소는 외부 분해효소 활성 및 내부 분해효소 활성 모두 가질 가능성을 뒷받침해 준다.

• 생명과학회지
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• 제15권3호
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• pp.479-485
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• 2005

2002년 2월부터 2005년 2월까지 성인 및 소아 호홉기질환자 994명의 상기도 도말물에서 M. pneumoniae 균주를 분리하고, 분리 균주의 ciprofloxacin, ofloxacin, minecline, tetracycline, sparfloxacin, josamycin, erythromycin에 대한 감수성 검사를 실시하였으며, 분리된 균주의 235 rRNA domain II와 V에서 erythromycin저항성 변이가 일어났는가를 PCR과 유전자 염기서열분석으로 erythromycin에 감수성인 M. pneumonine균주의 염기서열과 비교분석하여 확인하였다. 호흡기질환자에서 M. pneumoniae의 분리율은 123/994$(12.4\%)$이었으며, 분리된 M. pneumoniae 균주의 minocycline, sparfloxacin, tetracycline, ciprofloxacin, ofloxacin, josamycin, erythromycin MIC 범위는 각각 $0.015\~0.25,\;0.06\~0.5,\;0.06\~0.5,\;0.25\~0.5,\;0.25\~0.5,\;0.015\~8.0,\;0.015\~8.0{\mu}m$이었다. 분리 동정된 M. pneumoniae 균주 중에서 erythromycin에 저항성인 균주가 60주$(48.8\%)$였으며, 모두가 ribosomal protein L4 영역과 23S rRNA domain V에 내성변이가 일어났으며, 이 중 2균주는 23S rRNA domain II에도 변이가 일어난 균주도 있었다. 국내에서 분리되는 M. pneumoniae균주의 $48\%$가 erytomycin에 저항성인 균주이므로 앞으로 이 균에 의한 폐렴의 치료에 주의가 요구된다.

• 한국가금학회지
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• 제31권4호
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• pp.273-281
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• 2004

본 연구는 생물학적 탄산가스 고정화에 사용되는 Euglena를 단세포 단백 사료 자원으로 이용하고, DHA를 강화시킨 변종을 육계의 사료에 첨가하였을 때 그 이용성과 도체지방산에 미치는 영향에 대해 알아보고자 실시하였다. 시험 1에서는 갓 부화한 육계병아리(Ross) 210수를 반복당 10수씩 3반복으로 배치하였다. 처리구는 에너지 함량과 조단백 질함량이 전기에는 3,150 kcaHg, $22\%$, 후기에는 3,200 kcal/kg, $19\%$가 되도록 한 대조구사료에 EG(Euglena gracilis Z.)를 0.25, 0.50, $1.0\%$ 첨가한 구와 EGBD(Euglen gracilis Z. bleached and DHA enriched)를 0.5, 1.0, $2.0\%$ 첨가한 구의 7처리구로 하였다. 시험 2에서는 육계병아리(Ross) 250수를 반복당 10수씩 5반복으로 배치하였다. 처리구는 대조구 사료에 EGD(Euglena gracilis Z. DHA enriched)를 0.5, $1.0\%$ 첨가한 구와 EGBD를 0.5, $1.0\%$ 첨가한 구의 5처리구로 하였다. 사양시험은 5주간 실시하였고 매주 사료섭취량과 증체량, 사료요구율 및 폐사율을 측정하였다. 사양시험종료 후 대사시험을 실시하고, 가슴살을 채취하여 지방산을 분석하였다. 시험 1의 결과를 보면, 증체량은 시험 전 기간 동안 유의한 차이를 보이지 않았다. 사료요구율은 대조구에 비해 Euglena 첨가구들이 좋은 경향이 있었다. 단백질의 이용율은 EG를 첨가한 구들이 EGBD를 첨가한 구들보다 높은 경향이 있었다. 가슴살 내 지방산은 linoleic acid와 arachidonic acid가 $1.0\%$의 EG를 첨가한 처리구에서 유의하게 높았다. EPA는 유의한 차이는 없었지만, EGBD를 첨가한 구들에서 증가하는 경향을 보였다. DHA는 $2.0\%$의 EGBB를 첨가한 구에서 유의적으로 가장 높았고, 대조구를 포함한 다른 처리구들에 비해 EGBD를 첨가한 구들이 유의적으로 높았다. 실험 2에서도 증체량은 유의한 차이를 보이지 않았고, 사료요구율은 시험 전 기간동안 EGBD를 첨가한 구가 유의적으로 좋았다. 가슴살의 지방산 조성의 결과를 보면 linoleic acid는 대조구가 유의하게 높았다. EP4 DHA와 lignoceric acid는 모두 $1.0\%$의 EGBD를 첨가한 구가 유의적으로 가장 높았고, Euglena를 첨가한 구들 모두가 대조구보다 높았으며, 그중 EGBD를 첨가한 구들이 유의적으로 더 높게 나타났다. 결론적으로, Euglena의 첨가가 육계의 생산성에는 크게 영향을 미치지 못했지만, 시험 2에선 EGBD의 첨가가 사료효율을 개선시키는 경향.이 있었다. DHA를 강화시킨 Euglena인 EGD나 EGBD의 첨가는 계육 내의 DHA를 비롯한 $\omega$-3 계열의 지방산의 수준을 높이는데, 특히 EGBD는 DHA 강화 효과가 높았다.