• Applied Biological Chemistry
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• 제47권4호
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• pp.430-433
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• 2004

Lilium cv. Casablanca pollen grains stored at $-70^{\circ}C$ were grown in pollen germination medium with Agrobacterium tumefaciens LBA4404 cells harboring pBI121 for 18 hr at $27^{\circ}C$. Following this, cefotaxime (250 mg/L) was treated for 6 hr to eradicate the bacterial cells. Histochemical GUS analysis revealed that the transgenic pollen displayed deep blue color mostly from 12 hr after the co-cultivation. Presence of $200\;{\mu}M$ acetosyringone was determined not to be more effective for GUS transformation than its absence. GUS DNA integration in the transgenic pollen genomic DNA was clearly demonstrated by Southern blot analysis.

• Journal of Plant Biotechnology
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• 제32권4호
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• pp.257-262
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• 2005

Agrobacterium과 자엽절 공동배양으로 대두 형질전환체를 생산하였다. 멜론 (슈피VIP품종)의 자엽절 절편은 선발 마커로서 bar와 reporter로서 gus유전자가 포함된 pPTN289 또는 선발마커로서 nptII유전자와 reporter로서 gus유전자로 제작된 pPTN290벡터를 LBA4401, GV3101, EHA101에 각각 형질전환하여 공동 배양하였다. 최대 형질전환빈도(0.16%)는 EHA101 (pPTN289)균주로 공동배양한 자엽절 절편을 glufosinate가 첨가된 선발배지에서 얻을 수 있었으며, 최종적으로 glufosinate저항성과 잎 ($T_0$), 화기 ($T_0$), 종자 ($T_1$) 및 유식물체 ($T_1$)에서 GUS양성반응을 나타내는 5개체를 얻었다. Southern분석에 의하여 GUS유전자가 멜론 genomic DNA에 도입되어 있음을 확인하였다.

• Journal of Plant Biotechnology
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• 제31권4호
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• pp.267-271
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• 2004

국내 고구마 율미 품종의 배발생 캘러스를 Agrobacterium 매개 방법을 이용하여 형질전환 식물체를 개발하였다. 배발생 캘러스를 7일 동안 전배양 한 후 Agrobacterium과 2일 간 공동배양할 경우 일시적인 형질전환 효율이 가장 높았다. Agrobacterium과의 공동배양 후 배발생 캘러스를 1mg/L 2,4-D, 100mg/L kanamycin, 400mg/L claforan 이 첨가된 선발배지에서 4주 간격으로 계대배양하였다. 선발된 kanamycin 저항성 캘러스를 2,4-D를 제거한 선발배지로 옮겨 체세포배를 유도하였으며 이후 소식물체로 발달하였다. Southern 분석으로 1-3 copy의 GUS 유전자가 고구마 염색체내로 도입되었음을 확인하였다. 또한 조직학적 분석으로 GUS 유전자가 형질전환 고구마의 배발생 캘러스, 재분화 식물체의 잎, 엽병, 및 뿌리 조직에서 강하게 발현됨을 알 수 있었다.

• Journal of Microbiology and Biotechnology
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• 제19권12호
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• pp.1650-1655
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• 2009

The $\beta$-glucuronidase (GUS) gene from Lactobacillus brevis RO1 was cloned and expressed in Escherichia coli GMS407. The GUS gene was composed of 1,812 bp, encoding a 603-amino-acid protein belonging to glycosyl hydrolase family 2 with three conserved domains. The amino acid similarity was higher than 70% with the $\beta$-glucuronidases of various microorganisms, yet less than 58% with the $\beta$-glucuronidase of L. gasseri ADH. Overexpression and purification of the GUS was performed in $\beta$-glucuronidase-deficient E. coli GMS407. The purified GUS protein was 71 kDa and showed 1,284 U/mg of specific activity at optimum conditions of pH 5.0 and $37^{\circ}C$. At $37^{\circ}C$, the GUS remained stable for 80 min at pH values ranging from 5.0 to 8.0. The purified enzyme exhibited a half-life of 1 h at $60^{\circ}C$ and more than 2 h at $50^{\circ}C$. When the purified GUS was applied to transform baicalin and wogonoside into their corresponding aglycones, $150\;{\mu}M$ of baicalin and $125\;{\mu}M$ of wogonoside were completely transformed into baicalein and wogonin, respectively, within 3 h.

• Journal of Plant Biotechnology
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• 제29권4호
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• pp.223-228
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• 2002

본 연구실에서 개발된 particle inflow gun (PIG)은 조작이 간편하고, 사용비용도 저렴하며, 식물 세포 내의 유전자 도입효율이 높은 특징을 갖고 있다. PIG 장비를 이용하여 벼 캘러스 내로의 유전자 도입 조건을 검토하기 위해서 사용된 vector는 pIG121Hm으로서 T-DNA 내부에 intron GUS ($\beta$-glucuronidase)와 hygromycin 및 kanamycin 저항성 유전자를 포함하고 있다. 또한 벼 캘러스 내에 물리적으로 DNA를 도입할 때에 DNA 도입 효율과 관계가 높은 요인들을 GUS의 발현빈도를 통하여 조사하였다. 그 결과 gold particle에 DNA를 부착하는 과정에 사용되는 spermidine과 calcium chloride의 경우 무첨가구에 비해 16 mM의 spermidine과 1.5 M의 calcium chloride 첨가구에서 GUS 발현율이 각각 2배, 3배 증가하였다. 그리고 1회 분사되는 gold particles양이 2 mg의 경우 가장 높은 GUS 발현율을 보여주었으며, 또한 PIG장비의 분사거리와 헬륨의 압력은 벼의 배양세포의 경우 12cm의 분사거리에서 3.5 bar (50 psi)의 헬륨압력으로 분사하였을 때 GUS 발현율이 가장 높았다. 이상의 결과에서 PIG 장비를 이용한 유전자 도입은 본 연구에서 검토한 최적의 조건을 이용하였을 경우 기존에 많이 사용되고 있는 Biolistic Gun (Bio-Rad 사)과 거의 비슷한 유전자 도입효율을 보여 주었다. 특히 PIG 장비의 경우 조작이 매우 간편하고, 분사에 사용되는 일회용 부품이 필요하지 않기 때문에 대량의 반복실험을 필요로 하는 연구에서 손쉽게 사용되리라 기대된다.

• 식물조직배양학회지
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• 제21권5호
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• pp.309-314
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• 1994

간편하면서도 효율적인 단자엽 식물의 형질전환 기법을 개발하기 위하여 배발생 세포를 직접 electroporation하여 DNA를 도입하는 실험을 벼와 잔디에서 실시하였다. 잔디는 수정 후 3주된 미숙배에서 캘러스를 유도하였으며, 2.4-D가 1 mg/L 함유된 액체 MS배지로 옮겨 진탕배양한 것을 electroporation 실험에 이용하였다. 벼는 20 mm 정도의 미숙화서 유래의 캘러스를 액체 N$_{6}$배지(1 mg/L 2.4-D 함유)에서 진탕배양하여 획득한 세포주를 사용하였다. 액체 진탕배양한 세포괴를 GUS expression vector인 pGA1074 (30 $\mu\textrm{g}$/ml)와 함께 MS 액체 배지에서 Electroporation하였다. 세포벽과 세포막을 통한 세포로의 DNA 전이는 GUS 유전자의 발현 여부 및 정도에 따라 결정하였다. 400 volt, 800 $\mu$F capacitance로 electroporation 처리된 벼와 잔디의 세포괴들은 200 ${\mu}\ell$ (packed cell volume)의 세포괴 당 25 unit (1 unit=파란색을 띤 독립된 세포군) 이상의 빈도로 GUS 활성을 나타내었다. 반면에 무처리 세포주 및 처리한 비배발생 세포주에서는 GUS 발현이 일어나지 않음을 반복적으로 확인차였다. 따라서 electroporation에 의한 벼와 잔디의 형질전환실험에서 원형질체 대신 intact한 배발생 세포가 이용될 수 있음을 의미한다

• 생명과학회지
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• 제19권3호
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• pp.378-383
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• 2009

본 연구는 Agrobacterium을 이용한 효율적인 호접란 형질 전환 시스템의 확립을 위해 실시하였고, 호접란 PLB의 대량증식을 위한 배지 조성은 하이포넥스 기본 배지에 활성탄 1g/l, 티아민 0.1 mg/l 및 sucrose 30 g/l을 배지에 첨가한 경우 PLB가 안정적으로 증식되었다. 계대 배양시 PLB 절단 방법이 PLB의 생존과 증식에 큰 영향을 미치며, PLB 위쪽으로 부터 1/3 부위를 절단하여 계대 배양한 경우 90% 이상의 가장 높은 증식률을 나타났다. Agrobacterium 접종 시 균이 묻어 있는 침으로 PLB를 찔러 상처를 내는 dipping 방법을 이용하여 형질전환 효율을 높일 수 있었다. Agrobacterium 배양액의 흡광도 값이 0.8일 때 형질전환 효율이 가장 높았고, 형질전환된 PLB의 선발은 1 mg/l 정도의 저농도 hygromycin을 함유한 배지에 계대배양 하는 것이 효율적이었다. 호접란 형질전환체를 먼저 GUS assay를 통하여 선발하였고, 선발된 개체로부터 genomic DNA를 추출하여 GUS 특이적 primer와 probe로 PCR과 Southern blot 분석을 수행하고 유전자의 도입여부를 조사한 결과 GUS 염색된 형질전환체에서 정상적으로 GUS 유전자가 도입된 것을 확인할 수 있었다.

• 현장농수산연구지
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• 제25권4호
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• pp.138-147
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• 2024

본 연구는 국내 밀 43 품종에 대한 A. tumefaciens 형질 전환 효율을 검정하기 위해 GUS staining 분석을 수행한 것으로서 대부분의 밀 형질전환 연구가 특정 품종에 국한되어 있기 때문에 국내 장려 밀 품종에 대한 형질전환 효율에 영향을 미치는 조건에 대한 검정이 필요하다. 국내 밀 품종 중 32개에서 1개 이상의 조직에 염색된 신호가 관찰되었으며 4개 품종에서는 염색된 신호가 관찰되지 않았고 6개 품종에서 과도한 A. tumefaciens 성장이 관찰되었고, 7개 품종은 미성숙배의 크기 등의 이유로 GUS staining 분석이 불가능하여 추가 분석에서 제외하였다. 국내 밀 품종별 A. tumefaciens 감염 효율 비교 결과, 백립계 8개 품종 및 적립계 28개 품종에서는 평균적으로 유의한 차이가 없었다. 특히 조농밀, 조품밀, 새올밀, 조중밀, 새금강밀 등 적립계 품종에서 90% 이상의 높은 감염 효율이 관찰되었고, 전체 품종 중 22개는 50% 이상의 효율을 나타내었다. 본 연구를 통하여 조농밀 및 새올밀은 미성숙배에서 전체 조직에서 강한 GUS 발현으로 형질전환에 적합한 품종으로 나타났으며 금강 품종은 백립계에서 상대적으로 높은 발현을 보여 A. tumefaciens을 이용한 형질전환에 적합한 것으로 확인되었다. 추가적인 연구를 통해 품종의 조직배양 효율을 검정하고, 안정적인 GUS 발현 효율을 조사하는 것이 필요하며, 이를 통해 밀 형질전환에 이용 가능한 품종을 더욱 정밀하게 선발할 수 있을 것으로 판단된다. 해당 연구 결과는 국내 밀품종의 형질전환 효율을 높이기 위한 기초 자료로 활용 가능할 것이다.

• 한국작물학회지
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• 제49권5호
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• pp.434-439
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• 2004

Medicago truncatula is a model plant for molecular genetic studies of legumes and plant-microbe interactions. To accelerate finding of genes that play roles in the early stages of nodulation and stress responses, a trans-genic plant was developed that contains a promoter­reporter fusion. The promoter of rip], a Rhizobium-induced peroxidase gene, was fused to the coding region of $\beta-glucuronidase (GUS)$ gene and inserted into a modified plant transformation vector, pSLJ525YN, in which the bar gene was preserved from the original plasmid but the neomycin phosphotransferase gene was replaced by a polylinker. Transformation of M. truncatula was carried out by vacuum infiltration of young seedlings with Agrobacterium. Despite low survival rates of infiltrated seedlings, three independent transformants were obtained from repeated experiments. Southern blot analyses revealed that 7 of 8 transgenic plants of the T 1 generation contained the bar gene whereas 6 $T_1$ plants contained the GUS gene. These results indicate that vacuum infiltration is an effective method for transformation of M. truncatula. The progeny seeds of the transgenic plants will be useful for mutagenesis and identification of genes that are placed upstream and may influence the expression of rip] in cellular signaling processes including nodulation.

• Journal of Plant Biotechnology
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• 제2권3호
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• pp.135-142
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• 2000

The activity of promoter sequences was evaluated in garlic cells using the $\beta$-glucuronidase (GUS) gene as a reporter. Histochemical GUS assay indicated transient GUS activity in leaf, callus and root cells 48 hours after particle bombardment transformation. Quantitative fluorometric assays in extracts of transformed leaves demonstrated that the CsVMV promoter induced the highest level of gene expression, which was, on average, ten fold the level induced by CaMV35S and by the Arabidopsis Act2 promoters and two fold the level expression observed with a construct containing a double CaMV35S plus the untranslated leader sequence from AMV. No activity or very low levels were observed when cells were transformed with plasmids rontaining the typical monocot promoters, Actl, from rice or the Ubi-1, from maize. The green fluorescent protein (GFP) was also tested as a marker gene for garlic transformation. Intense fluorescence was observed in leaf, callus and root cells transformed with a construct containing the gfp gene under control of the CaMV35 Promoter. No fluorescence was detected when the gfp was under control of the Ubi-1 promoter.