본 연구는 동맥경화의 원인으로 알려진 사람 oxidized low density lipoprotein (LDL)에 대한 chitin sulfate의 산화억제 효과에 대하여 실험하였다. 사람 LDL을 쥐의 마크로파지 유도 oxidized LDL로 산화시킬 때 chitin sulfate를 첨가하여 TBARS와 전기영동에 의한 이동상 및 $O_2$소거 기능을 확인하였다. 사람 LDL에 macrophage를 이용해서 LDL을 산화시킬 때 chitin sulfate를 50~100 $\mu$M 첨가하였을 때 억제 효과가 높았으며, chitin sulfate를 100 $\mu$M 첨가하였을 때 LDL의 산화가 거의 억제되었고, 전기영동에 의한 이동거리도 100 $\mu$M chitin sulfate에서 완전히 억제되었다. 그리고 phorbol myristate acetate를 처리한 마크로파아지 유도 활성 산소의 소거 효과는 chitin sulfate의 농도가 100$\mu$M일 때 거의 소거하였다. 이상의 결과로 보아 chitin sulfate는 동맥경화의 예방에 효과적이라는 결론을 얻었다.
In order to produce fuctional chitooligosaccharides, a strain excreting mainly endo-type chitinase suitable for chitooligosaccharides production was newly screened and identified as Aspergillus fumigatus JC-19. The chitinase excretion was repressed in nutrient rich medium but stimulated by colloidal chitin indicating that the chitinase is inducible type enzyme. Maximum secretion of the enzyme was observed at pH 7.0 and 37$\circ$C . The growth and chitinase production patterns of Aspergillus fumigatus JC-19 showed that the cell growth reached maximum after 4-5 days with final chitinase concentration of 0.46 unit per ml. Excreted chitinase was purified by ammonium sulfate precipitation, colloidal chitin adsorption, anion exchange chromatography, and gel filtration, respectively, and measured M.W of 50 KDa. The enzyme reaction carried out both by crude and purified chitinase showed that the purified chitinase accumulated more chitooligosaccharides of 1-6 degree of polymerization than that of crude chitinase.
충치 형성 과정에 중요한 불용성 글루칸의 합성과 관련된 sucrose-glucan glucosyltransferase (Gtf)를 Streptococcus mutans Ingbritt 의 배양액에서 염석과, Sephadex G-150, CM-Sephadex, DEAE-Sephadex column을 통과시켜 정제하였다. 회수율 6.3%였으며, 정제율 13배였다. sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE)에서 이 효소의 분자량은 66 kDa이며, 최적 pH와 온도는 각각 6.0과 $40^{\circ}C$이였다. 이 효소는 0.1 mM $Hg^{2+}$, $Cu^{2+}$, $Al^{3+}$에 의하여 22-59% 저해되었다. 이 효소는 2 mM 자이리톨에 의하여 40% 저해 받았으며, 0.05% 수용성 키토산, 글리콜 키토산, 글리콜 키틴에 의하여 35-45% 저해되었다. 키틴 유도체가 Gtf 활성을 억제한다는 보고는 본 연구가 최초이며, 이는 키틴 유도체를 구강청결제의 소재로 활용할 수 있음을 제시한다.
An extracellular chitinase-producing bacterial strain induced by colloidal chitin was isolated from sea sand and was identified to be a member of the genus Cytophaga. The chitinase was purified successively by 30-60% ammonium sulfate fractionation, and DEAE-Bio gel A column, Octyl-Sepharose CL-4B column, and DEAE-Bio gel A column chromatographies. The enzyme had a molecular mass of 59.75 kDa, and the amino terminal amino acid sequence was ATPNAPVISW MPTDXXLQNXS. The enzyme acted better on colloidal chitin as a substrate than on chitosan. For colloidal chitin and chitosan (Degree of Acetylation, 15-25%), $K_{cat}$ values were 0.60U/mg and 0.08U/mg, respectively. HPLC analysis of the enzymatic reaction products showed that the chitinase produced mostly N-acetyl-D-glucosarnine and di-N-acetylchitobiose. The optimum temperature and pH for the enzyme were $50^{\circ}C$ and 4.0, respectively. N-Bromosuccinimide and $Hg^{2+}$ inhibited the chitinase activity as much as 90%, and $Sb^{3+}$, diethylpyrocarbonate, and $Ag^{+}$ inhibited it by 50-70%.
산업폐기물인 꽃게의 껍질로부터 chitin을 탈아세틸화시켜 분자량이 서로 다른 chitosan을 제조하였다. Rhodamine 6G(Rh 6G)-sodium dodecyl sulfate(SDS)계 및 Rh 6G-chitosan계들의 흡수 및 형과 spectra를 조사하였고, chitosan의 분자량 및 pH에 따른 Rh 6G-SDS-chitosan계의 응집효과에 대해 조사하였다. Rh 6G-SDS계의 흡광도나 형광세기는 S/D(SDS 농도/Rh 6G 농도)=32 이하에서 감소하다가 그 이상에서 다시 증가하였다. 부유물질(SS) 제거율이나 투광도로부터 S/D=32에서 chitosan을 첨가한 Rh 6G-SDS-chitosan계의 응집 성능이 Rh 6G-SDS계에 비해 훨씬 우수함을 알 수 있었다. 그리고 chitosan의 농도나 분자량이 크면 클수록, S/D 첨가 범위는 32에서 100까지 확대되는 것을 알 수 있었다. 부유물질의 제거율은 chitosan의 분자량이 클수록 pH 2∼9에서 우수한 성능을 가지는 반면, pH 12 이상에서 부유물질의 제거율은 현저히 저하되는 것을 알 수 있었다.
자연계에서 진균류와 절족동물의 외피를 이루는 주된 다당류인 chitin(N-acetyl glucosamine polymer)의 $\beta$-1, 4-lingkage를 가수분해하는 Strepto-myces sp. 115-5 균주로부터 생성되는 chitinase를 정제하여 그 성질을 조사하였다. 48시간 진탕배양하여 생성된 chitinase를 ammonium sulfate처리, 1차 Sephadex G-100, DEAE-Cellulose, 2차 Sephadex G-100 column chromatography하여 정제하였으며 그 순도를 CM-Sephadex C-50 column chromatography 및 polyacryla-mide gel electrophoresis로서 확인하였다. 이 chitinase는 chitin과 chitosan을 가수분해 할수 있었으나 cellulose는 분해할수 없었고 chitin을 기질로서 사용하였을 경우 Km value가 3.6mg/ml이며 Vmax가 100 $\mu$mole/hr였다. Activation energy는 산 가수분해보다 훨씬 낮은 3.66kca1/mole이었고 분자량은 Sephadex G-100을 사용한 column chromatography에서 56,000 daltons으로 나타났으며, 이 chitinase의 등전점은 pH3.0에서 보여졌다.
길항미생물로 분리.동정된 Pseudomonas sp. 3098이 생산하는 chitinase를 황산암모늄 침전, DEAE-cellulose column chromatography, Bio-Gel P-100에 의한 겔여과, 1차 및 2차 hydroxyapatite column chromatography 과정을 거쳐 회수율 5.8%,정제도 15.7배의 정제효소를 얻었고, 효소의 순도는 SDS-PAGE로 확인하였으며, 분자량은 45kDa으로 추정되었다. 정제된 chitinase의 최적 온도와 pH는 45$^{\circ}C$와 5.0이었고, 정제효소는 pH 5.0~9.0 사이에서 안정하였고, 5$0^{\circ}C$, 3시간 및 6$0^{\circ}C$, 30분까지는 비교적 안정하였다. 금속염 및 화학물질의 영향을 조사한 결과 Fe$^{2+}$, Ag$^{1+}$ 및 단백질변성제인 Hg$^{2+}$ 이온에 의해 효소활성이 크게 저해되었고, p-CMB, iodoacetic acid, urea, 2,4-DNP 및 EDTA에 의해 효소활성이 약간 저해되었다. 기질특이성을 조사한 결과 colloidal chitin 및 shrimp shell 유래의 chitin은 분해가능하였으나 crab shell 유래의 chitin, chitosan등은 분해하지 못하였다. Colloidal chitin에 대한 본 효소의 Km값은 0.11%였고, 분해율은 24시간 반응시 34%였다.
A Screening test was carried out for chitin-decomposing bacteria. In 100 samples from soil, fesh water and sea water, 7 strains of Chitinolytic bacteria were isolated. 5-3K which exhibited the highest chitinase activity was identified as Aeromonas hydrophila and cultural conditions from maximum chitinase production were determined. Optimum Chitinase production was obtained at pH 7, 33eC and with chitin concentration greater tham 0.2% Under optimal conditions, high yields of Chitinase were obtained in 16-30 hours. Chitinase was purified by ammonium sulfate precipitation and sephadex G-100 gel-filtration from the culture filtrgte.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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