• 한국미생물·생명공학회지
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• 제38권1호
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• pp.40-45
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• 2010

Agarose의 $\beta$-1,4결함을 분해하는 Zobellia galactanivorans 유래의 $\beta$-agarase 유전자(agaB)는 클로닝 되었고, AOX1(alcohol oxidase 1, methanol inducible) promoter 하류에 Saccharomyces cerevisiae mating factor alpha-1 secretion signal($MF{\alpha}1$)를 연결하여 $MF{\alpha}1$-AgaB를 구축하였다. 구축된 plasmid pPIC-AgaB(9 kb)를 Pichia pastoris genome에 HIS4 gene 위치에 integration하였고, colony PCR을 통해 확인하였다. Methanol 첨가 배지에서 자란 형질전환체는 iodine solution의 첨가에 의해 red halos를 보였으며, P.pastoris에서 agaB의 효율적 분비 발현을 확인하였다. SDS-PAGE와 zymographic analysis에서 $\beta$-agarase의 분자량은 약 53 kDa으로 추정되었으며, 15% 정도의 N-linked glycosylation이 일어났음을 알 수 있었다. P.pastoris GS115/pPIC-AgaB의 48시간 baffled flask culture에서 세포외 $\beta$-agarase의 활성은 각각 0.1, 0.5, 1% methanol의 유도에 의해 1.34, 1.42 그리고 1.53 units/mL의 활성을 보였다. 대부분의 $\beta$-agarase의 활성은 세포 외에서 관찰되었고, 분비효율은 98%였으며 분비시의 glycosylation에 의해 열안정성도 증가되었다.

• 한국미생물·생명공학회지
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• 제43권4호
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• pp.314-321
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• 2015

대한민국 제주도 연안 해수로부터 agarase를 생산하는 균주 S4를 분리하였다. 균주 S4는 그람-음성의 막대형 세포로 부드러운 베이지색 원형 콜로니를 형성하며, 한 개의 극성 편모를 갖는다. S4 균주는 $15-42^{\circ}C$, 0.5-5%(w/v) NaCl, pH 6.0-9.0, 0.5-5%(w/v) NaCl 농도에서 안정된 성장을 보인다. S4 균주의 G+C content는 49.93 mol%, 세포내 주요 지방산 (>15%)은 $C_{18:1}{\omega}7c$, $C_{16:0}$, Summed feature 3(comprising $C_{16:1}{\omega}7c/iso-C_{15:0}$ 2-OH)이다. 16S rRNA 염기서열, 생화학적 및 분류학정 특징에 기초하여 S4 균주를 Vibrio sp. S4로 명명하였다. 0.1% agar를 첨가한 액체배지에서 S4 균주는 72시간에 세포농도와 agarase 활성이 최대치를 보였다. 반면, agar 를 첨가하지 않은 배양액에서의 agarase 활성은 무시할만한 수준이었으며, 이는 균주의 agarase 유전자 발현이 agar에 의해 유도됨을 시사하고 있다. 균주 S4가 세포외부로 분비하는 총 agarase는 $45^{\circ}C$와 pH 7.0에서 최상의 효소 활성을 보였으며, agarose를 분해하여 (neo)agarotetraose와 (neo)agarohexaose를 생산하였다.

• 생명과학회지
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• 제32권10호
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• pp.778-783
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• 2022

본 연구에서는 해양 한천분해세균인 Simiduia sp. SH-2을 분리하여 생장과 agarase의 특성을 조사하였다. 경상남도 남해군 미조면 연안에서 채취한 해수를 Marine agar 2216 배지에 도말하여 한천분해활성을 보이는 SH-2 균주를 분리하였다. 선택된 SH-2 균주는 16S rDNA 염기서열분석을 통해 Simiduia sp. SH-2로 명명하였다. Simiduia sp. SH-2 균주의 배양액으로부터 한천분해효소를 획득하여 한천분해활성을 측정하였다. Simiduia sp. SH-2 유래 한천분해효소의 최고활성은 625 U/l로 나타났다. 한천분해활성은 40℃에서 최고치를 나타내었으며, 40℃에서의 활성을 100%로 하였을 때 20℃에서 31%, 30℃에서 71%의 상대활성을 나타내었다. 최적 pH는 pH 7.0으로 pH 7.0의 활성을 100%로 하였을 때 pH 6.0과 pH 8.0에서 각각 94%와 89%의 상대활성을 나타내었다. 한천분해효소는 20, 30℃에서 2시간 동안 열처리한 후에도 96%의 잔존활성을 나타내었고, 40℃에서 2시간 동안 열처리한 후에도 49%의 잔존활성을 나타내었다. Simiduia sp. SH-2는 neoagarotetraose 및 neoagarohexaose 등의 neoagarooligosaccharides를 생성하여 β-agarase를 생산하는 균주로 확인되었다. 따라서 Simiduia sp. SH-2 균주와 이 균주의 β-agarase는 식품, 화장품, 의약품 산업에서 기능성 소재의 생산자로서 유용하게 활용될 수 있을 것으로 기대된다.

• 한국생물공학회:학술대회논문집
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• 한국생물공학회 2005년도 생물공학의 동향(XVI)
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• pp.31-32
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• 2005

Neoagaro-oligosaccharides are produced only by enzymatic degradation of agarose by ${\beta}-agarase.^{1)}$ Neoagaro-oligosaccharides inhibit the growth of bacteria, slow the rate of degradation of starch, are used as low-calorie additives to improve food quality, and have macrophage-stimulating activity. Furthermore, neoagarobiose is a rare reagent that has both moisturizing effect on skin and whitening effect on melanoma $cells.^{2)}$ An agar-degrading marine bacterium was isolated from the sea water at the northeast coast in Cheju island, Korea. The strain was gram negative, aerobic, and motile rod. The 16S rRNA of the strain had the closest match of 98% homology, with that from Agarivorans albus. On the basis of several phenotypic characters and a phylogenetic analysis, this strain was designated Agarivorans sp. JA-1. In solid agar plate, Agarivorans sp. JA-1 produced a diffusible agarase that caused agar softening around the colonies. Agarivorans sp. JA-1 was cultured for 36 hr in marine broth 2216 (Difco, USA) and the supernatant that containing an extracellular ${\beta}-agarase$ was prepared by centrifugation of culture media. The enzyme exhibited relatively strong activity at $40^{\circ}C$ and was stable up to $60^{\circ}C$. Using PCR primers derived from the ${\beta}-agarase$ gene of Vibrio sp., the gene encoding ${\beta}-agarase$ from Agarivorans sp. JA-1 was cloned and sequenced. The structural gene consists of 2931 bp encoding 976 amino acids with a predicted molecular weight of 107,360 Da. The deduced amino acid sequence showed 99% and 34% homology to $agaA^{2)}$ and $agaB^{2)}$ genes for ${\beta}-agarase$ from Vibrio sp., respectively. The expression plasmid for ${\beta}-agarase$ gene of Agarivorans sp. JA-1 is being constructed and the recombinant enzyme will be biochemically characterized.

• Journal of Microbiology and Biotechnology
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• 제24권1호
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• pp.19-25
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• 2014

An extracellular agarase was purified from Bacillus sp. BI-3, a thermophilic agar-degrading bacterium isolated from a hot spring in Indonesia. The purified agarase revealed a single band on sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis, with an apparent molecular mass of 58 kDa. The optimum pH and temperature of the agarase were 6.4 and $70^{\circ}C$, respectively. The activity of the agarase was stable at high temperatures, and more than 50% activity was retained at $80^{\circ}C$ for 15 min. Furthermore, the enzyme was stable in the pH range of 5.8-8.0, and more than 60% of the residual activity was retained. Significant activation of the agarase was observed in the presence of $K^+$, $Na^+$, $Ca^{2+}$, $Mg^{2+}$, and $Sr^{2+}$; on the other hand, $Ba^{2+}$, $Zn^{2+}$, $Cu^{2+}$, $Mn^{2+}$, $Co^{2+}$, $Fe^{2+}$, and EDTA inhibited or inactivated the enzyme activity. The components of the hydrolytic product analyzed by thin-layer chromatography showed that the agarase mainly produced neoagarobiose. This study is the first to present evidence of agarolytic activity in aerobic thermophilic bacteria.

• 생명과학회지
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• 제17권11호
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• pp.1601-1604
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• 2007

Agarivorans sp. JA-1 유래의 내열성 ${\beta}-agarase$ 유전자의 분비형 과발현과 재조합효소분해산물의 항균효과를 확인하였다. B. subtilis 168, DB104, ISW1214의 3가지 재조합발현 숙주를 비교하여 ISW1214 균주가 LB배지에서 배양 9시간에 총 효소활성 52,460 U과 비활성 201 U/mg의 최대 발현량을 보이는 것을 확인하였다. 이는 E. coli BL21 균주에 비해 총 효소활성은 약 90배, 비활성은 약 100배 증가한 결과이다. 재조합 ${\beta}-agarase$의 기질로 저가의 한천을 사용하여 neoagarobiose, neoagarotetraose 등 의 neoagarooligosaccharide를 생산하였으며, 생산된 neoagarooligosaccharides는 그람양성 세균인 B. subtilis와 그람음성 세균인 E. coli 모두의 성장을 저해하는 항균활성이 있음을 확인하였다. 따라서 본 연구에서 생산된 재조합 ${\beta}-agarase$와 재조합 효소의 한천분해 산물은 식품산업 등에 사용가능한 천연 항균제 생산에 활용이 가능할 것으로 기대된다.

• Journal of Microbiology and Biotechnology
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• 제29권2호
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• pp.235-243
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• 2019

A special eosinophilic agarase exo-type ${\beta}$-agarase gene, AgaDL6, was cloned from a marine agar-degrading bacterium, Flammeovirga sp. HQM9. The gene comprised 1,383-bp nucleotides encoding a putative agarase AgaDL6 of 461 amino acids with a calculated molecular mass of 52.8 kDa. Sequence analysis revealed a ${\beta}$-agarase domain that belongs to the glycoside hydrolase family (GH) 16 and a carbohydrate-binding module (CBM_4_9) unique to agarases. AgaDL6 was heterologously expressed in Escherichia coli BL21 (DE3). Enzyme activity analysis of the purified protein showed that the optimal temperature and pH of AgaDL6 were $50^{\circ}C$ and 3.0, respectively. AgaDL6 showed thermal stability by retaining more than 98% of activity after incubation for 2 h at $50^{\circ}C$, a feature quite different from other agarases. AgaDL6 also exhibited outstanding acid stability, retaining 100% of activity after incubation for 24 h at pH 2.0 to 5.0, a property distinct from other agarases. This is the first agarase characterized to have such high acid stability. In addition, we observed no obvious stimulation or inhibition of AgaDL6 in the presence of various metal ions and denaturants. AgaDL6 is an exo-type ${\beta}$-1,4 agarase that cleaved agarose into neoagarotetraose and neoagarohexaose as the final products. These characteristics make AgaDL6 a potentially valuable enzyme in the cosmetic, food, and pharmaceutical industries.

• 한국해양바이오학회지
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• 제8권1호
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• pp.1-9
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• 2016

The hydrolysis of biomass to fermentable sugar (saccharification) and to oligosaccharide is an essential process in biotechnology including biorefinery and biofood. Various macroalgae are commercially cultivated in several Asian countries as a useful resource for food and agar production. Agar is a major component of the cell walls of red algae that can be hydrolyzed by agarase. Agarases are classified into ${\alpha}$-agarase (E.C. 3.2.1.158) and ${\beta}$-agarase (E.C. 3.2.1.81) according to the cleavage pattern and grouped in the glycoside hydrolase (GH) family (GH-16, GH-58, GH-86, GH-96, and GH-118) based on the amino acid sequences of the proteins. Agarases have been isolated from various bacteria found in seawater and marine sediments. To increase productivity of the enzyme, a research on recombinant enzymes has been done. The application of recombinant agarase can be possible in the various filed such as energy, food, cosmetics, medical and so on. This paper reviews the source, biochemical characteristics and production system of recombinant agarases for further study.

• 생명과학회지
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• 제26권4호
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• pp.453-459
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• 2016

경상남도 남해군 미조면 연안으로부터 채취한 해수를 Marine agar 2216 배지에 도말하여 한천분해활성을 보이는 SH-4 균주를 분리하였다. 선택된 SH-4 균주는 16S rDNA 염기서열분석을 통해 Simiduia sp. SH-4로 명명하였다. Simiduia sp. SH-4 균주의 배양액으로부터 한천분해효소를 획득하여 한천분해활성을 측정하였다. 한천분해활성의 강도에 있어서 Simiduia sp. SH-4 유래 한천분해효소의 최고활성은 120.4 U/l로 나타났다. 한천분해활성은 30℃에서 최고치를 나타내었으며, 30℃에서의 활성을 100%로 하였을 때 20℃에서 30%, 40℃에서 75%의 상대활성을 나타내었다. 최적 pH는 pH 6.0으로 pH 6.0의 활성을 100%로 하였을 때 pH 5.0과 pH 7.0에서 각각 91%와 59%의 상대활성을 나타내었다. TLC 분석 결과, Simiduia sp. SH-4는 neoagarotetraose 및 neoagarobiose 등의 neoagarooligosaccharides를 생성하는 것으로 보아 β-agarase를 생산하는 균주로 확인되었다. 따라서 Simiduia sp. SH-4균주와 이 균주가 생산하는 β-agarase는 식품, 화장품, 의약품 산업에서 기능성소재 생산자로서 유용하게 활용할 수 있을 것으로 기대된다.

• 생명과학회지
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• 제18권1호
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• pp.103-108
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• 2008

Agar로부터 oligosaccharides를 제조하기 위하여 효소(agarase)를 이용한 분해법이 시도되면서 agarase의 균주의 분리 및 유전자에 대한 많은 연구가 수행되고 있다. 본 연구에서는 해양으로부터 agarase를 생성하는 균주를 분리 동정하고 균주의 특성을 조사하였다. 분리된 균주는 VITEK 2 compact version 분석 결과 Sphingomonas paucimobilis AS-1로 동정되었다. 정제된 효소의 최적 활성 조건 및 agar 분해산물의 항산화활성을 조사하였다. 분리된 균주의 최적배양조건은 marine broth 2216에서 온도 $27^{\circ}C$, pH 7일 때 가장 균주의 생육이 높았다. Agarase 효소는 salt침전, ion exchange와 gel filtration chromatography에 의해 114.4 units/mg으로 104배 정제되었다. 정제된 agarase의 SDS-PACE 결과 분자량이 약 80 kDa의 band를 얻었다. 최적 효소활성은 온도 $40^{\circ}C$, pH 7일 때 나타났다. Agar 첨가한 배지에 agar 분해균을 접종한 후 분해산물의 시간에 따른 항산화활성은 12시간 배양 후 72%의 가장 높은 전자소거능(EDA)을 나타내었다. Agar 분해산물은 식중독균의 생육은 저해하는 것으로 나타났으며 젖산균의 생육은 약간 촉진하는 경향을 나타냈다.