• 한국어병학회지
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• 제37권1호
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• pp.49-60
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• 2024

A viable but non-culturable (VBNC) state is a survival strategy adopted by bacteria when faced with unfavorable environmental conditions, rendering them unable to grow on nutrient agar while maintaining low metabolic activity. This study explored the impact of temperature and nutrient availability on inducing VBNC state in Edwardsiella piscicida, the most important bacterial fish pathogen, and assessed its pathogenicity at VBNC state. E. piscicida was suspended in filtered sterile seawater and exposed to three different temperatures (4, 10, and 25℃) to induce the VBNC state. Subsequently, the induced VBNC cells were subjected to resuscitation by either raising the temperature to 28℃ or inoculating them in brain heart infusion broth supplemented with 1% NaCl. A propidium monoazide (PMA)-qPCR method was also developed to selectively quantify live (VBNC or culturable) E. piscicida cells. The results showed that the bacteria entered the VBNC state after approximately 1 month at 4℃ and 25℃, and 2 months at 10℃. The VBNC E. piscicida cells were successfully revived within 3 days in a nutrient-rich environment at 28℃, highlighting the significance of temperature and nutrition in inducing and resuscitating the VBNC state. In pathogenicity tests, resuscitated E. piscicida cells exhibited high pathogenicity in olive flounder comparable to cultured bacteria, while VBNC cells showed no signs of infection, suggesting they are unlikely to resuscitate in fish. In conclusion, this study contributes to our understanding of fish pathogen ecology by investigating the characteristics of the VBNC state under varying temperature and nutrition conditions.

• Journal of Dairy Science and Biotechnology
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• 제41권4호
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• pp.157-162
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• 2023

In the field of microbiology, numerous types of bacteria live dormant to survive stresses such as pasteurization and antibiotics. Some bacteria become 'persisters' by inactivating their ribosomes, allowing them to 'sleep' through stress and revive when the stress has been removed. Under stress, some cells morph into hollow, lifeless structures known as 'cell shells.' In microbiology, these cells have been confused with viable cells in the 'viable but non-culturable cells' phenomenon. Therefore, this review addressed the concept that when revival occurs, the always-viable persister cells revive, instead of the dead cell husks.

• 미생물학회지
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• 제38권3호
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• pp.180-185
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• 2002

직접생균수측정법(direct viable count; DVC)과 평판법(p1ate count; PC)을 이용하여 시판되고 있는 먹는샘물, 약수, 도시 인근 지역과 축산농가 밀집지역의 음용 지하수로부터 채수된 시료에 대하여 정략적 평가를 실시하였다. DVC법에 의한 생균수는 전균수(total direct count: TDC)의 약 30~80%, 평판법에 의한 생균수는 DVC의 약1~30%로 나타났다. 이와 같은 결과는 지하수내에 배양 불가능한(viable but non-culturable: VBNC)세균이 높은 비율로 존재함이라고 판단된다. 한편, 통상농도의 영양배지(nutrient broth; NB)와 이를 $10^-2 -2/배로 희석한 영양배지(diluted nutrient broth; DNB)및 R2A배지를 이용하여 계수한 결과, 통상농도의 NB배지에 비해 저영양배지인 DNB와 R2A에서 2~50배 이상 높은 계수치를 나타내었다. 이와 같은 결과로부터 지하수와 같이 빈영양한 환경 내에는 통상농도의 NB배지에서는 중식이 현저히 저해되고 저영양배지에서 중식 가능한 저영양세균이 다수 분포해 있음이라 판단되었다.

• 한국생명과학회:학술대회논문집
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• 한국생명과학회 2007년도 제48회 학술심포지움 및 추계국제학술대회
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• pp.61.1-61.1
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• 2007

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• 미생물학회지
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• 제42권2호
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• pp.116-124
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• 2006

직접 생균수 측정법(DVC)과 평판계수법(PC)을 이용하여 소나무림과 상수리나무림 토양에 분포하는 세균군집의 정량적 평가를 실시한 결과, DVC법에 의해 계수된 생균수에 대해 평판법에 의해 계수된 생균수 1% 미만으로 나타났다. 이상의 결과로부터 산림토양 내에 평판배양법으로는 배양이 곤란한 난배양성(viable but non culturable; VBNC) 세균이 99% 이상 존재해 있는 것으로 판단되었다. 이들 VBNC 세균의 군집구조 해석을 위하여 토양으로부터 직접 DNA를 추출하고 16S rDNA-ARDRA 분석을 통하여 계통학적 특성을 검토하였다. 소나무림과 삼수리나무림 토양으로부터 각각 111 clones, 108 clones을 획득하고 HaeIII 절편양상에 따라 30 groups과 26 groups의 ARDRA group으로 분류하였다. 각 ARDRA group으로부터 대표 clone을 선발하여 16S rDNA 염기서 열을 결정한 결과, 소나무림 토양의 경우 ${\alpha}$-proteobacteria (12 clones), ${\gamma}$-proteobacteria (3 clones), ${\delta}$-proteobncteria (1clone), Flexibacter/Cytophaga (1 clone), Actinobacteria (4 clones), Acidobacteria (4 clones), 그리고 Planctomycetes (5 clone)의 7개의 계통군이 확인되었으며, 상수리나무림 토양에서는 ${\alpha}$-proteobacteria (4 clones), ${\gamma}$-proteobacteria (2 clones), Actinobacteria (10 clones), Acidobacteria (8 clones), Planctomycetes (1 clone), 그리고 Verrucomicrobia (1clone)로 6개의 다양한 계통군이 확인되었다. 이상, 소나무림과 상수리나무림 토양 내에 존재하는 99% 이상의 VBNC 세균군집의 대부분은 미배양성 혹은 미동정균으로 계통학적으로 다양한 미지의 미생물로 구성되어 있음이 확인되었다.

• 한국식품영양과학회지
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• 제45권7호
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• pp.1041-1048
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• 2016

본 연구에서 가금류의 주요 병원성 식중독 균을 인위적으로 오염시킨 훈제오리육을 진공포장 조건에서 10, 15, $24^{\circ}C$에 저장하면서 유통기한 동안 관찰한 미생물의 증식 및 생존 결과 Campylobacter jejuni는 저장기간 이내에 사멸하는 경향을 보였으며, Salmonella Typhimurium과 Listeria monocytogenes는 균주의 성장 속도에는 차이가 있었으나 증식하는 경향을 보였다. 훈제오리의 유통온도는 $10^{\circ}C$이며 유통기한이 약 30일인 것을 고려했을 때, 초기 오염 수준이 Campylobacter 균주에 의한 식중독을 유발하게 되는 균수 500 CFU/g 수준 이하에서는 유통기한 내에 문제가 없을 것으로 생각한다. 그러나 낮은 온도에서 저항성이 증가하며 살아있으나 배양은 불가능한 상태인 VBNC 상태의 C. jejuni의 특성에 따라 적절한 조건에서 회복되어 병원성을 일으킬 가능성이 있으므로 C. jejuni에 대한 지속적인 관리가 필요하다. 또한, S. Typhimurium과 L. monocytogenes의 경우 일반적인 유통/보관 온도인 $10^{\circ}C$에서도 증식이 가능하며, 특히 가공품 및 RTE 식품은 적절한 가열처리 없이 소비할 경우 식중독 발생 가능성이 높다는 점에서 제품 제조 단계에서부터 위생적인 관리가 필요하다. 본 연구에서는 C. jejuni biofilm cells을 인위적으로 오염시킨 훈제오리육을 진공포장 하여 일반 유통/보관 온도인 $10^{\circ}C$와 실온, 그리고 일반적으로 C. jejuni가 증식 가능한 온도인 $36^{\circ}C$에서 저장하였으나, C. jejuni biofilm cell은 훈제오리에서는 모든 온도에서 재증식이 불가능한 것으로 관찰되었다. 또한, $10^{\circ}C$의 저온에서 유도한 VBNC 상태의 C. jejuni를 훈제오리에 인위적으로 오염시키고 혐기적 조건에서 $42^{\circ}C$에 1일간 저장하며 VBNC 상태의 C. jejuni의 재증식 가능성을 분석하였으나, 최적 증식 온도인 $42^{\circ}C$에서도 재증식은 관찰되지 않았다. 이처럼 본 연구에서는 biofilm을 형성한 C. jejuni도 VBNC 상태의 C. jejuni는 살아 있으나 훈제오리에서의 증식은 관찰되지 않았다. 따라서 훈제오리에서의 C. jejuni의 위험성은 매우 적은 것으로 생각한다. 그러나 C. jejuni의 경우 매우 적은 양으로도 식중독을 일으킬 수 있고 C. jejuni biofilm 및 VBNC의 특성에 따라 잠재적인 위험성을 포함하는 동시에 유통/보관 온도인 냉장 온도에서 더 잘 살아남는다는 점에서 식중독 발생의 주요 원인으로 작용할 수 있는 교차오염과 전이를 예방하는 것이 중요하므로 이에 대한 관리가 강조되어야 할 것으로 생각한다.

• 미생물학회지
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• 제39권3호
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• pp.181-186
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• 2003

형광현미경을 이용한 기존의 직접생균수측정(DVC)법을 변형하여 산림토양의 각 층위에 분포하는 난배양성 토양세균의 정량적 평가를 시도하였다. 기존의 방법에서 사용된 DNA합성저해제(nalidixic acid; 100${\mu}g$/ml, pipemidic acid; 50 ${\mu}g$/ml, piromidic acid; 50 ${\mu}g$/ml)보다 5배 높은 농도를 사용한 결과 토양세균 군집의 세포분열이 배양24시간까지 분히 억제되어 기존의 DVC법보다 10배 이상 높은 계수치를 얻었다. 토양시료를 제균수로 원심 세척한 경우 DVC는 전균수(TDC)의 약 I% 미만을 나타내어 첨가된 기질의 이용능을 정확히 판정할 수 있었다. 형광현미경을 이용하여 DVC법에 의해 검출된 생균수는 전균수의 18-44%를 나타내었고, 평판법(PC)에 의해 계수된 생균수는 전균수의 1% 미만을 나타내어 DVC법이 평판법에 비해 100-2000배 이상 높은 계수치를 나타내었다. 이는 평판법으로는 배양할 수 없는 난배양성(VBNC)세균이 토양 내에 다수 존재해 있음으로 판단되었고, DVC법에 의해 난배양성 토양세균을 정량적으로 검출할 수 있는 가능성이 확인되었다. 영양기질로써 통상농도의 NB배지와 NB를 $10^{-2}$로 희석한 DNB배지를 사용하여 DVC법과 평판법에 의한 계수 결과를 비교한 결과 모든 시료에서 DNB배지에서의 생균수는 NB배지보다 5～10배 이상 높은 값을 나타내어 산림토양의 각 층위에 저영양세균(oligotrophic bacteria)이 다수 분포해 있음으로 추정되었다.

• Journal of Microbiology and Biotechnology
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• 제27권5호
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• pp.995-1004
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• 2017

Culture-dependent methods, such as heterotrophic plate counting (HPC), are usually applied to evaluate the bacteriological quality of hemodialysis water. However, these methods cannot detect the uncultured or viable but non-culturable (VBNC) bacteria, both of which may be quantitatively predominant throughout the hemodialysis water treatment system. Therefore, propidium monoazide (PMA)-qPCR associated with HPC was used together to profile the distribution of the total viable bacteria in such a system. Moreover, high-throughput sequencing of 16S rRNA gene amplicons was utilized to analyze the microbial community structure and diversity. The HPC results indicated that the total bacterial counts conformed to the standards, yet the bacteria amounts were abruptly enhanced after carbon filter treatment. Nevertheless, the bacterial counts detected by PMA-qPCR, with the highest levels of $2.14{\times}10^7copies/100ml$ in softener water, were much higher than the corresponding HPC results, which demonstrated the occurrence of numerous uncultured or VBNC bacteria among the entire system before reverse osmosis (RO). In addition, the microbial community structure was very different and the diversity was enhanced after the carbon filter. Although the diversity was minimized after RO treatment, pathogens such as Escherichia could still be detected in the RO effluent. In general, both the amounts of bacteria and the complexity of microbial community in the hemodialysis water treatment system revealed by molecular approaches were much higher than by traditional method. These results suggested the higher health risk potential for hemodialysis patients from the up-to-standard water. The treatment process could also be optimized, based on the results of this study.

• 미생물학회지
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• 제43권3호
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• pp.201-209
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• 2007

송이 자생군락 토양 내 세균군집의 정량적 평가를 수행한 결과 CFDA 형광염색법을 이용해 직접 계수된 생균수는 $7.4{\pm}1.19{\times}10^8{\sim}1.07{\pm}0.17{\times}10^9cells/g$ soil로 육즙영양배지(nutrient broth, NB)에서 배양된 생균수는 CFDA 계수치의 $5{\sim}8%$로 계수되었으며, $10^{-2}$으로 희석한 NB(DNB)배지에서는 $40{\sim}47%$의 계수치를 나타내었다. 이상의 결과로부터 송이 자생군락 토양내에는 배양이 곤란한 난배양성(viable but non-culturable; VBNC)세균이 다수 존재해 있는 것으로 추정되었다. 송이 자생군락 토양내 세균군집의 계통학적 특성을 검토하기 위해 토양으로부터 직접 DNA를 추출하고 16S rDNA-ARDRA cluster 분석을 통하여 대표 clone의 16S rDNA 염기서열 분석을 수행하였다. 송이 자생군락 토양으로부터 구축된 총 115 clone은 31 ARDRA cluster로 분류되었으며, ${\alpha}-,\;{\beta}-,\;{\gamma}-$ Proteobacteria, Acidobacteria, Actinobacteria 그리고 Firmicutes의 6개 계통군이 확인되었다. 이들 계통군 중 약 85%가 Acidobacteria 계통군에 속하여 압도적인 우점군임이 확인되어 매우 독특한 계통학적 특성을 나타내었다.

• 한국생물공학회:학술대회논문집
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• 한국생물공학회 2001년도 추계학술발표대회
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• pp.918-922
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• 2001

In a previous study, we have isolated a number of lactobacilli from Korean women, and one of them (KLB46) was identified as Lactobacillus crispatus by 16S rRNA gene sequencing. For the ecological treatment of bacterial vaginosis (BV) cell suspension of L. crispatus KLB46 was instillated into BV patients. L. crispatus KLB46 was found to persist for several days in cell suspension with no nutrients. In this study, in order to assess the influence of starvation on physiological activity, we compared the viability and culturability of KLB46 following suspension in various buffer solutions. A pair of in situ fluorescent dye was used to assess viability (i.e. membrane integrity) and the culturability was examined by plate count assay. A rapid epifluorescence staining method using the LIVE/DEAD Bacterial Viability Kit $(BacLight^{TM})$ was applied to estimate both viable and total counts of bacteria in cell suspension. $BacLight^{TM}$ is composed of two nucleic acid-binding stains ($SYTO\;9^{TM}$ and propidium iodide). $SYTO\;9^{TM}$ penetrates all bacterial membranes and stains the cells green while propidium iodide only penetrates cells with damaged membranes, therefore the combination of the two stains produces red fluorescing cells. Optimal staining conditions for $BacLight^{TM}$ were found to be with 0.0835M $SYTO\;9^{TM}$ and 0.05M propidium iodide for 15 min incubation at room temperature in dark. When cells were microscopically examined during 140 hours of starvation, the culturability decreased markedly while the viability remained relatively constant, which suggests that large fraction of KLB46 cells became viable but non-culturable (VBNC) upon starvation.