충무연안의 한실포에서 인평포에 이르는 굴${\cdot}$홍합 양식장(Fig.1)을 중심으로 1975년 7월부터 1976년 9월까지 매월, 해수, 이토, 굴 및 담치에서 V.parahaemolyticus와 V. alginolyticus의 분포를 조사한 결과를 요약하면 다음과 같다. 1. 해수, 이토, 굴 및 담치, 420개 시료에서 parahaemolyticus 51균주와 V. alginolyticus 160 균주를 분리하였다. 2. 월별분리율은 7월-9월에 가장 높았다. 3. 시료별 parahaemolyticus의 분리율은 이토$(28\%)$, 해수$(24\%)$, 담치$(5\%)$ 및 굴$(4.2\%)$의 순이였다. 4. 조사지점별 분리율은 station 1 과 5가 다른 조사지점에 비해 가장 높았다. 5. 분리된 211 균주의 형태적 생리적 생화학적성상은 전형적인 parahaemolyticus 및 V. alginolyticus와 및 일치하였다.
Vibrio alginolyticus, a Gram-negative marine bacterium, is one of the causative agents of fish vibriosis. Its virulence factors and pathogenesis mechanism are barely known, except for some extracellular products (ECPs) that are known to be regulated by quorum sensing system. Therefore, the present study used a microarray to analyze the transcription profiles of the wild-type V. alginolyticus and a deletion mutant of luxO, the pivotal regulator in Vibrio quorum sensing systems, which resulted in the identification of a putative virulence factor, MviN. Quantitative real-time reverse transcription PCR confirmed that the transcription of mviN was upregulated in the luxO mutant when compared with wild-type, and down regulated in a luxO-con complemented strain. Furthermore, Western blotting indicated that MviN was greatly induced during the late-exponential and stationary phases of growth, indicating that the expression of MviN was cell-density dependent and quorum sensing regulated in V. alginolyticus. Meanwhile, the mviN null mutant displayed a much slower growth rate than the wild type, signifying the essential role of MviN in V. alginolyticus. Western blotting also revealed that MviN was present as an extracellular protein in V. alginolyticus. When epithelioma papulosum cyprini (EPC) cells were treated with the ECPs of the mviN mutant, no cytotoxicity was observed, whereas EPC cells treated with the wild type exhibited pathological changes, which increased with the ECPs concentration and treatment time. Therefore, the results demonstrated that MviN is a LuxO-regulated ECPs component and involved in the pathogenicity of V. alginolyticus.
Vibrio alginolyticus (V. alginolyticus) 는 우리나라 전 연안에서 높은 빈도로 발견되며 인간 및 어패류에 감염을 유발시키는 박테리아의 일종이다. 본 연구는 서해안 양식장의 해수와 어패류에서 V. alginolyticus와 이에 대한 특이적인 용균성 파아지를 분리하였으며 분리된 파아지의 형태학적 특성을 전자현미경으로 확인 하였다. 또한 파아지의 핵산의 종류 및 구조 단백질의 특성 대한 연구가 수행되었다. 분리된 파아지는 형태학적으로 60 nm의 육각형 두부와 20 nm의 짧은 미부를 가진 podoviridae과로 분류되었다. 핵산을 분리한 결과 23 Kb 크기의 DNA로 판명 되었으며 구조 단백질은 37.8 kDa과 198 kDa 사이에 7종류의 단백질 분획이 존재함을 확인 하였다.
미세조류 증식 저해균 Shewanella sp. SR-14와 연안해역에서 우점종으로 분포하는 세균인 Vibrio alginolyticus가 규조, Chaetoceros calcitrans의 증식에 미치는 영향 그리고 V. ajginolyticus가 Shewanella sp. SR-14의 C. calcitrans 증식저해 활성에 미치는 영향을 혼합배양으로 측정하였다. Shewsnella sp. SR-14와 해수에서 분리한 V. alginolyticus는 미세조류 배양용 무기배지에서 단독 또는 혼합 배양하여도 잘 증식하였으며, C. calcitrans와 혼합배양시 Shewanella sp. SR-14는 조류증식을 저해한 반면 V alginolyticus는 이 조류의 증식을 촉진하였다. 조류가 첨가된 배지에 Shewanella sp. SR-14의 최초 접종균수가 V. alginolyticus와 거의 같거나 1 log 정도 적게 접종되었을 때에는 C. calcitrans에 대한 Shewanella sp. SR-14의 증식 저해활성이 유지되었으나 V. alginolricus의 최초균수가 Shewanella sp. SR-14보다 3 log 이상 많았을 때에는 조류증식 저해활성이 나타나지 않았다.
Vibrio alginolyticus, a marine fish and shellfish pathogen, has been found at a high frequency around the coastal areas of Korea. Vibrio alginolyticus was purified from various diseased fish, and a V. alginolyticus-specific bacteriophage was isolated from seawater obtained from fish farms located on the west coast of Korea. In a bacterial lysis experiment using the phage and antibiotics, tetracycline, $10^3$ cfu/ml of V. alginolyticus were completely lysed by both the phage and the antibiotic, suggesting that the purified phage in the study could be utilized as an alternative to antibiotics in the control of fish and shellfish diseases caused by V. alginolyticus.
V. alginolyticus 138-2, a marine halophilic bacterium, produced an extracellular amylase with a molecular weight of ca. 56,000. The analysis of the digestion products of soluble starch by thin layer chromatography(TLC) revealed that the extracellular amylase of V. alginolyticus 138-2 is a saccharifying-type alpha-amylase. The alpha-amylase activity of the culture supernatant of soluble starch was optimal at pH 6.0 and 45$^{\circ}C$. Ca2+ slightly increased the alpha-amylase activity, whereas Hg2+, An2+, Cu2+, Ni2+, Fe2+, and Mn2+inhibited the enzymatic activity. Alkylating thiol group agent, iodoacetic acid did not affect the alpha-amylase activity, but reduced thiol reagents such as dithiothreitol, cysteine, and beta-mercaptoethanol stimulated theenzymatic activity. On the other hand, even if V. alginolyticus 138-2 is a marine halophilic bacterium, its alpha-amylase activity was significantly inhibited by NaCl.
The antimicrobial resistance patterns to the 10 antimicrobial agents of potential pathogenic vibrios isolated from seawater and a variety of farmed fishes, including oliver flounder (Payalichthys olivaceus), black rock fish (Sebastes schlegeli), red sea bream (Pagyus major) and sea bass (Lateolabyax japonicus), were investigated from May to October, 2004. A total of 314 strains of the genus vibrios were isolated from 126 collected samples, and the number of isolated strains of Vibrio payahaemolyticus and Vibrio alginolyticus were 194 and 120, respectively. Apparently $98.5\%$ of V. parahaemolyticus and $100\%$ of V. alginolyticus isolates demonstrated antimicrobial resistance against at least one antimicrobial agent. The resistance of V. parahaernolyticus isolates to ampicillin ($97.9\%$) was highest, followed by oxolinic acid ($26.8\%$), amikacin ($19.1\%$) and tetracycline and amoxicillin/clavulanic acid ($6.7\%$). V. alginolyticus isolates were resistant to ampicillin ($100\%$), solfamethoxazoleit,imethopenem ($25\%$), amikacln ($21.7\%$), amoxicillin/clavulanic acid ($15.8\%$), ciprofloxacin ($13.3\%$), and tetracycline and doxycycline ($11.7\%$). The rate of multiple antimicrobial resistance to at least four antimicrobials was higher in the V. alginolyticus isolates ($20.8\%$) than in the V. parahaemolyticus ($6.7\%$).
The alkaline serine protease asp, which was shown to be a virulence factor of Vibrio alginolyticus as a purified protein, was cloned from V. alginolyticus EPGS, a strain recently isolated from moribund Epinephelus coioides in an outbreak of vibriosis in a mariculture farm of Shenzhen. The asp null mutant was constructed by homologous recombination with suicide plasmid pNQ705-1. Compared with the wild-type strain, the asp null mutant exhibited a significant decrease of total extracellular protease activity, and caused a IS-fold decrease in virulence of V. alginolyticus. In our previous study, the luxO and $luxR_{val}$ genes from V. alginolyticus MVP01 were cloned and identified, and the luxO-$luxR_{val}$ regulatory couple was shown to regulate various genes expression, suggesting that it played a central role in the quorum sensing system of V. alginolyticus. In this study, the regulation of the asp gene was analyzed by using RT-PCR and quantitative real-time PCR methods; we proved that its transcription was greatly induced at the late stage of growth and was regulated by a luxO-$luxR_{val}$ regulatory system.
Vibrio species are Gram-negative basophils that are ubiquitous in seawater, increasing in number as the water temperature increases. Humans are usually infected by the consumption of contaminated seawater or seafood. V. alginolyticus infection in humans is mainly associated with infections of the skin and ears, such as acute otitis media and cellulitis. In this study, the distribution of V. alginolyticus along the coast of Jeju Island, and its relationship with water temperature, salinity, DO, and pH was investigated. The antibiotic susceptibility of the bacteria isolated was also tested. In seawater, the Daejeong area had the highest detection rate, with 13 cases (21.7%), and the Hallim area showed the lowest detection rate, with eight cases (13.3%) in. In shellfish, the Daejeong area had the highest rate, with seven cases (23.3%), and the Seongsan and Hallim areas had the lowest detection rate, with four cases (13.3%). The overall detection rate was the highest in Daejeong area, with 20 cases (22.2%), and the lowest in the Hallim area, with 12 cases (13.3%). The detection rate was highest when the water temperature was highest.
For the rapid diagnosis of vibriosis in penaeid shirmp, the indirect fluorescent antibody technique(IFAT) was established to detect Vibrio alginolyticus. The titers of the antisera used for this experiment were above 1280. Vibrio alginolyticus possesses the specific antigen, and also have antigens shared with other strains. When an V. alginolyticus-infected adult shirmp was tested by IFAT, V. alginolyticus was detected mainly in the muscle tissues near the injection point and the haemolymph but only few in other tissues. This result indicates that the pathogen bacteria could be detected by IFAT. Thus, it is suggested IFAT is more convenient and sensitive method than conventional plate method for the diagnosis of induced Vibrio infection in the penaeid shrimps.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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