An amino-terminal 14 amino acids deletion and three site-directed mutations were created to investigate the mechanism of induction and repression of MerR regulatory protein in R100 mer operon from gramnegative Shigella flexneri. The amino-terminal 14 amino acids deletion, Cysl17Ser, and Cys126Ser mutations abolished the inducibility of the mer operon and the Hisl18Ala mutation resulted in the reduction of inducibility (about 9.1 % remaining) in complementation experiment in the presence of $Hg^{2+}$ at subtoxic level ($1\mu M$). The complementation experiment with $Hg^{2+}$ absent showed that Hisl18Ala, Cys126Ser, and wild-type MerR could repress the operon but Cysl17Ser could not, and the amino-terminal deletion mutant could neither induce nor repress the R100 mer operon.
Park, Sun-Mi;Song, Sang-Jin;Choi, Ho-Jun;Uhm, Sang-Jun;Cho, Ssang-Goo;Lee, Hoon-Taek
한국발생생물학회:학술대회논문집
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한국발생생물학회 2003년도 제3회 국제심포지움 및 학술대회
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pp.121-121
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2003
The standard protocol for the production of transgenic mouse from ES-injected embryo has to process via chimera producing and several times breeding steps, In contrast, tetraploid-ES cell complementation method allows the immediate generation of targeted murine mutants from genetically modified ES cell clones. The advantage of this advanced technique is a simple and efficient without chimeric intermediates. Recently, this method has been significantly improved through the discovery that ES cells derived from hybrid strains support the development of viable ES mice more efficiently than inbred ES cells do. Therefore, the objective of this study was to generate transgenic mice overexpressing human resistin gene by using tetrapioid-ES cell complementation method. Human resistin gene was amplified from human fetal liver cDNA library by PCR and cloned into pCR 2.1 TOPO T-vector and constructed in pCMV-Tag4C vector. Human resistin mammalian expression plasmid was transfected into D3-GL ES cells by lipofectamine 2000, and then after 8~10 days of transfection, the human resistin-expressing cells were selected with G418. In order to produce tetraploid embryos, blastomeres of diploid embryos at the two-cell stage were fused with two times of electric pulse using 60 V 30 $\mu$sec. (fusion rate : 93.5%) and cultured upto the blastocyst stage (development rate : 94.6%). The 15~20 previously G418-selected ES cells were injected into tetraploid blastocysts, and then transferred into the uterus of E2.5d pseudopregnant recipient mice. To investigate the gestation progress, two El9.5d fetus were recovered by Casarean section and one fetus was confirmed to contain human resistin gene by genomic DNA-PCR. Therefore, this finding demonstrates that tetraploid-ES mouse technology can be considered as a useful tool to produce transgenic mouse for the rapid analysis of gene function in vivo.
여름느타리버섯의 단포자에 UV를 처리하여 pab 요구성 영양요구주를 작성하였으며 이 균의 균사에서 원형질체를 분리한 후 Coprinus pab 1유전자를 함유하는 plasmid를 이용하여 prototrophy로 형질전환 하였다. 형질전환율은 ${\mu}g$의 DNA 당 5개의 형질전환주를 얻을 수 있었다. 형질전환주는 Southern 분석결과 염색체 DNA 속으로 integration된 것으로 확인되었으며 영양생장과 생식 생장시 모두 안정하게 유지되었다. 형질전환주와 화합성인 다른 영양요구주와 교배후 자실체의 포자를 분리하여 유전분석 결과 pab 생합성 유전자 보다는 그 유전자 주위에 integration이 일어난 것으로 추정되었다.
Park, Jong-Hwa;Back, Jung-Ho;Hahm, Soo-Hyun;Shim, Hye-Young;Park, Min-Ju;Ko, Sung-Il;Han, Ye-Sun
Journal of Microbiology and Biotechnology
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제17권10호
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pp.1607-1615
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2007
We investigated the applicability of the TEM-l ${\beta}$-lactamase fragment complementation (BFC) system to develop a strategy for the screening of protein-protein interactions in bacteria. A BFC system containing a human Fas-associated death domain (hFADD) and human Fas death domain (hFasDD) was generated. The hFADD-hFasDD interaction was verified by cell survivability in ampicillin-containing medium and the colorimetric change of nitrocefin. It was also confirmed by His pull-down assay using cell lysates obtained in selection steps. A coiled-coil helix coiled-coil domain-containing protein 5 (CHCH5) was identified as an interacting protein of human uracil DNA glycosylase (hUNG) from the bacterial BFC cDNA library strategy. The interaction between hUNG and CHCH5 was further confirmed with immunoprecipitation using a mammalian expression system. CHCH5 enhanced the DNA glycosylase activity of hUNG to remove uracil from DNA duplexes containing a U/G mismatch pair. These results suggest that the bacterial BFC cDNA library strategy can be effectively used to identify interacting protein pairs.
We conducted a hospital case-control study by genotyping four potential functional single nucleotide polymorphisms (SNPs) to assess the association of Xeroderma pigmentosum complementation group F (XPF) with gastric cancer susceptibility, and role of XPF polymorphisms in combination with H.pylori infection in risk definition. A total of 331 patients with gastric cancer and 355 controls were collected. Four SNPs of XPF, rs180067, rs1799801, rs2276466 and rs744154, were genotyped by Taqman real-time PCR method with a 7900 HT sequence detector system. The gastric cancer patients were more likely to have smoking habit, a family history of cancer and H.pylori infection. We did not find any significant difference in the genotype distributions of XPF rs180067, rs1799801, rs2276466 and rs744154 between cases and controls. However, multivariate logistic analysis showed a non-significant decreased risk in patients carrying rs180067 G allele, rs1799801 T allele or rs2276466 T allele genotypes. A non-significant increased risk of gastric cancer was found in individuals carrying the rs744154 GG genotype. Stratification by H.pylori infection and smoking was not significantly different in polymorphisms of XPF rs180067, rs1799801, rs2276466 and rs744154. The four XPF SNPs did not show significant interaction with H.pylori infection and smoking status (P for interaction was 0.35 and 0.18, respectively). Our study indicated that polymorphisms in rs180067, rs1799801, rs2276466 and rs744154 may affect the risk of gastric cancer but further large sample size studies are needed to validate any association.
Alizadeh, Alireza;Javan-Nikkhah, Mohammad;Fotouhifar, Khalil-Berdi;Motlagh, Elahe Rabiee;Rahjoo, Vahid
The Plant Pathology Journal
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제26권3호
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pp.216-222
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2010
Fusarium proliferatum is the causal agent of stalk and root rot disease of maize, foot rot disease of rice, basal and root rot disease of onion and knife cut disease of sugarcane in Iran. In recent years, incidence and severity of these diseases have been increased in Iran. Fifty seven F. proliferatum single-spore isolates collected from diseased maize, rice, onion and sugarcane plants at different areas were used to study genetic diversity by determination of vegetative compatibility groups (VCGs). Chlorate-resistant nitrate non-utilizing (nit) mutants were recovered from selected isolates of F. proliferatum and used in complementation tests. All isolates in which both nit1 and NitM (or nit3) mutants were recovered, demonstrated self-compatibility. Vegetative compatibility tests by pairing nit mutants identified 30 VCGs among 57 isolates. Twenty-three isolates belonged to singlemember VCGs and the remaining 34 isolates, belonged to other seven multimember VCGs. Segregation of F. proliferatum isolates obtained from various area and host plants into different VCGs in Iran is reported for the first time. In this study, none of isolates obtained from rice complemented with any other isolates from onion and sugarcane and, non complementation occurred between onion and sugarcane isolates. Also, only one complementation occurred between one isolate of maize and one isolate of sugarcane and rice. Thus, a correlation between VCGs grouping and host preferences was founded. It is concluded that natural populations of F. proliferatum in Iran are probably genetically divergent and include isolates representing a potential risk for disease development.
We conducted an exploratory investigation of whether variation in six common SNPs of xeroderma pigmentosum complementation group F (XPF) is associated with risk of glioma in a Chinese population. Six single nucleotide polymorphisms (SNPs) were genotyped in 207 glioma cases and 236 cancer-free controls by a 384-well plate format on the Sequenom MassARRAY platform (Sequenom, San Diego, USA). The rs1800067 G and rs2276466 G allele frequencies were significantly higher in the glioma group than controls. Individuals with the rs1800067 GG genotype were at greater risk of glioma when compared with the A/A genotype in the codominant model, with an OR (95% CI) of 2.63 (1.04-7.25). The rs2276466 polymorphism was significantly associated with moderate increased risk of glioma in codominant and dominant models, with ORs (95% CI) of 1.90 (1.05-3.44) and 1.55 (1.07-2.47), respectively. The combination genotype of rs1800067 G and rs2276466 G alleles was associated with a reduced risk of glioma (OR=0.44, 95% CI=0.19-0.98). These findings indicate that genetic variants of the XPF gene have critical functions in the development of glioma.
Nguyen, Lan Huong;Lee, Na Joon;Hwang, Hyun Ha;Son, Hye Bin;Kim, Hye Ji;Seo, Eun Gyo;Nguyen, Huu Hoang;Park, Je Won
Journal of Microbiology and Biotechnology
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제29권3호
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pp.367-372
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2019
Deactivation of aminoglycosides by their modifying enzymes, including a number of aminoglycoside O-phosphotransferases, is the most ubiquitous resistance mechanism in aminoglycoside-resistant pathogens. Nonetheless, in a couple of biosynthetic pathways for gentamicins, fortimicins, and istamycins, phosphorylation of aminoglycosides seems to be a unique and initial step for the creation of a natural defensive structural feature such as a 3',4'-dideoxy scaffold. Our aim was to elucidate the biochemical details on the beginning of these C3',4'-dideoxygenation biosynthetic steps for aminoglycosides. The biosynthesis of istamycins must surely involve these 3',4'-didehydroxylation steps, but much less has been reported in terms of characterization of istamycin biosynthetic genes, especially about the phosphotransferase-encoding gene. In the disruption and complementation experiments pointing to a putative gene, istP, in the genome of wild-type Streptomyces tenjimariensis, the function of the istP gene was proved here to be a phosphotransferase. Next, an in-frame deletion of a known phosphotransferase-encoding gene forP from the genome of wild-type Micromonospora olivasterospora resulted in the appearance of a hitherto unidentified fortimicin shunt product, namely 3-O-methyl-FOR-KK1, whereas complementation of forP restored the natural fortimicin metabolite profiles. The bilateral complementation of an istP gene (or forP) in the ${\Delta}forP$ mutant (or ${\Delta}istP$ mutant strain) successfully restored the biosynthesis of 3',4'-dideoxy fortimicins and istamycins, thus clearly indicating that they are interchangeable launchers of the biosynthesis of 3',4'-dideoxy types of 1,4-diaminocyclitol antibiotics.
The argG gene of Corynebacterium glutamicum encoding argininosuccinate synthetase (EC6345) was cloned and sequenced. The gene was cloned by heterologous complementation of an Escherichia coli arginine auxotrophic mutant (argG/sup -/). The cloned DNA fragment also complements E. coli argD, argF, and argH mutants, suggesting a clustered organization of the genes in the chromosome. The coding region of the argG gene is 1,206 nucleotides long with a deduced molecular weight of about 44 kDa, comparable with the predicted size of the expressed protein on the SDS-PAGE. Computer analysis revealed that the amino acid sequence of the argG gene product had a high similarity to that of Mycobacterium tuberculosis and Streptomyces clavuligerus. Two conserved sequence motifs within the ArgG appear to be ATP-binding sites which correspond to 2 of the 3 conserved regions found in sequences of all known argininosuccinate synthetases.
Arabidopsis AHL gene encodes a 3'(2')-phosphoadenosine 5'-phosphate (PAP)-specific phosphatase that plays a role in the sulfate activation pathway. We complemented E. coli cysQ mutant defective in cysteine biosynthesis with the AHL gene. AHL cDNA was cloned into the prokaryotic expression vector pKK388-1 and transformed into the bacterial mutant. Since cysQ mutant is a leaky cysteine auxotroph only under aerobic conditions, the bacteria were grown in liquid media with vigorous shaking to provide more aeration. In cysteine-free medium, cysQ mutant and the mutant harboring empty vector did not grow well, whereas cells harboring AHL cDNA exhibited significantly improved growth with doubling time of approximately 3 h. cysQ is known to encode a 3'(2'),5'-diphosphonucleoside 3'(2')-phosphohydrolase (DPNPase). However, our data suggest that cysQ protein has PAP-specific phosphatase activity in addition to DPNPase activity. Microbial complementation procedure described in this paper is useful for structure-activity studies of PAP-specific phosphatases identified from microbes and plants.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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