S. fibuligera 균주는 생전분을 분해하는 활성이 있는 효모 균주이다. 본 연구에서는 첨가되는 젖산의 농도가 점차 증가하는 장기간 반복 회분식 배양 방법을 사용하는 적응진화를 통하여 S. fibuligera 균주의 젖산에 대한 내성을 증진시키고자 하였다. 진화된 균주인 S. fibuligera MBY1940 균주는 비성장속도 측정과 평판배지를 사용하는 성장분석을 통하여 모균주가 성장할 수 없는 젖산 농도 2.5%에 대해서도 내성을 나타내는 것을 확인하였다. 전자현미경 관찰을 통하여 젖산이 첨가된 스트레스 조건에서 모균주는 신장된 세포 형태와 세포막에 손상을 입은 것으로 보아 진화된 균주에 비해 젖산에 대하여 상대적으로 취약한 것으로 판단되었다.
본 논문은 대체식품 및 화장품 원료로 사용되는 미강을 발효를 통해 기능성과 경쟁력을 증가시키는 것을 목표로 하였다. 5종류의 누룩에서 분리한 Saccharomycopsis fibuligera 50종의 균주 중 효소 활성이 우수한 6균주와 표준균주를 이용한 발효미강물의 𝛼-amylase, CMCase, 𝛽-glucosidase, protease 등의 효소 활성을 통해 비교한 결과, A8균이 KCTC 7806 균주에 비하여 13.7%, 21.1%, 50.3%, 10.0%의 우수한 효소 활성을 보였다. 발효의 결과지표로서 ABTS, DPPH 검사를 시행한 결과, A8으로 발효한 미강이 KCTC 7806 균주로 발효한 미강에 비하여 1.12배, 1.28배의 항산화능이 있음을 확인하였다. 본 논문으로, S. fibuligera 표준균주인 KCTC 7806 보다 우수한 S. fibuligera A8 균주를 확인할 수 있었다. 또한, 선행연구과제의 항염활성 및 항독성 결과와 더불어 우수한 효소 활성과 항산화능 결과를 통해 S. fibuligera A8 균주를 통한 미강 발효물이 대체식품 및 화장품 원료로서의 기능성과 가격 경쟁력을 증가시킬 수 있음을 확인하였다.
The nucleotide sequence of the TRP1 gene encoding phosphoribosyl anthranilate isomerase in yeast Saccharomycopsis fibuligera was determined by degenerate polymerase chain reaction and genome walking. Sequence analysis revealed the presence of an uninterrupted open-reading frame of 759 bp, including the stop codon, encoding a 252 amino acid residue. The deduced amino acid sequence of Trp1 in S. fibuligera was 43.5% homologous to that of Komagataella pastoris. The cloned TRP1 gene (SfTRP1) complemented the trp1 mutation in Saccharomyces cerevisiae, suggesting that it encodes a functional TRP1 in S. fibuligera. A new auxotrophic marker to engineer starch-degrading yeast S. fibuligera is now available. The GenBank Accession No. for SfTRP1 is KR078268.
본 논문은 대체식품 및 화장품 원료로 사용되는 미강을 발효를 통해 기능성과 경쟁력을 증가시키는 것을 목표로 하였다. 미강 추출물과 누룩에서 분리된 Saccharomycopsis fibuligera A8로 발효된 미강 추출물을 이용해 세포독성과 항염효과를 확인하였다. 세포 독성의 경우 미강 추출물의 경우 100 ㎍/mL에서 세포독성을 보였으나 발효 미강 추출물의 경우에는 세포독성을 보이지 않았다. 한편 nitric oxide, IL-6, TNF-α, IL-1β와 같은 염증 지표를 통해 항염효과를 확인한 결과, 미강 추출물은 nitric oxide, TNF-α만 100 ㎍/mL이상의 농도에서 항염효과를 보였다. 발효 미강 추출물의 경우에는 각각 25 ㎍/mL, 25 ㎍/mL, 50 ㎍/mL, 50 ㎍/mL의 농도에서 항염효과를 보여 더 낮은 농도로 항염효과를 나타내는 것을 확인하였다. 한편 S. fibuligera A8 사균체의 세포 독성 및 항염 효과를 실험한 결과 발효 산물에서 사균체 역시 유효하게 작용하는 것을 알 수 있었다.
누룩으로부터 MBY1276, 1280, 1282, 1320, 1322, 1324 및 MBY 1327로 각각 명명된 전분을 분해하는 효모균주를 분리하였다. 이들 균주는 18S rRNA 영역의 ITS 단편 및 26S rDNA 영역의 D1/D2 단편의 염기서열 해석 및 탄소원 대사특성 분석을 통하여 S. fibuligera로 동정하였다. 상주지역에서 수집된 누룩으로부터 분리된 MBY1320 균주는 대조구 균주인 S. fibuligera KCTC7806 및 누룩으로부터 분리된 다른 S. fibuligera 균주에 비해 고온에서 상대적으로 높은 비성장속도를 나타내었다. 전분을 분해하는데 필요한 효소인 ${\alpha}$-amylase 및 glucoamylase 효소활성을 측정한 결과 MBY1320 균주의 ${\alpha}$-amylase 효소활성은 대조구 균주보다 낮지만 glucoamylase 효소활성은 고온에서 상대적으로 우수한 것으로 나타났다. 효소활성 분석결과는 MBY1320 균주가 표준균주 및 다른 S. fibuligera 균주와 비교하여 고온에서 상대적으로 높은 비성장속도를 나타내는 것을 뒷받침하는 결과로 판단되었다. 가용성 전분을 이용한 회분식 배양 결과 MBY1320 균주는 표준균주 보다 $42^{\circ}C$에서 우수한 성장속도 및 에탄올 생산속도를 나타내었다. 본 연구를 통하여 기존에 보고된 S. fibuligera 균주보다 고온에서 glucoamylase 효소활성 및 비성장속도가 우수한 S. fibuligera 균주를 보고하는 바이다.
유용한 미생물을 탐색하던 중, 제주도의 전통발효식품에서 화장품소재로 활용이 가능한 Saccharomycopsis fibuligera을 분리하였다. 본 연구에서는 안토시아닌 배당체를 많이 함유한 블랙커런트추출물(blackcurrant fruit extract, BE)을 S. fibuligera로 발효시켰다. 블랙커런트추출물(BE)과 발효된 블랙커런트추출물(fermented blackcurrant fruit extract, FBE)의 성분 분석을 위해 HPLC분석을 실시하였다. 그 결과, delphinidin과 cyanidin의 생물전환을 확인할 수 있었다. 블랙커런트추출물(BE)과 발효된 블랙커런트추출물(FBE)의 항산화 효능을 검증하기 위해 DPPH 및 ABTS 라디칼소거활성을 수행하였다. 또한 항염증 효능을 확인하기 위해 LPS(lipopolysaccharide)로 염증반응을 유도시킨 RAW 264.7 대식세포에서의 Nitric Oxide (NO)생성 저해력과 western blot분석을 통한 염증관련 단백질 iNOS와 COX-2의 발현 저해를 확인하였다. 그 결과, 발효된 블랙커런트추출물(FBE)은 항산화 및 항염증 효과를 가지고 있어 화장품을 위한 효과적인 원료로 사용 가능할 것으로 사료된다.
Two genes encoding probable α-ʟ-arabinofuranosidase (E.C. 3.2.1.55) isozymes (ABFs) with 92.3% amino acid sequence identity, ABF51A and ABF51B, were found from chromosomes 3 and 5 of Saccharomycopsis fibuligera KJJ81, an amylolytic yeast isolated from Korean wheat-based nuruk, respectively. Each open reading frame consists of 1,551 nucleotides and encodes a protein of 517 amino acids with the molecular mass of approximately 59 kDa. These isozymes share approximately 49% amino acid sequence identity with eukaryotic ABFs from filamentous fungi. The corresponding genes were cloned, functionally expressed, and purified from Escherichia coli. SfABF51A and SfABF51B showed the highest activities on p-nitrophenyl arabinofuranoside at 40~45℃ and pH 7.0 in sodium phosphate buffer and at 50℃ and pH 6.0 in sodium acetate buffer, respectively. These exoacting enzymes belonging to the glycoside hydrolase (GH) family 51 could hydrolyze arabinoxylo-oligosaccharides (AXOS) and arabino-oligosaccharides (AOS) to produce only ʟ-arabinose, whereas they could hardly degrade any polymeric substrates including arabinans and arabinoxylans. The detailed product analyses revealed that both SfABF51 isozymes can catalyze the versatile hydrolysis of α-(1,2)- and α-(1,3)-ʟ-arabinofuranosidic linkages of AXOS, and α-(1,2)-, α-(1,3)-, and α-(1,5)-linkages of linear and branched AOS. On the contrary, they have much lower activity against the α-(1,2)- and α-(1,3)-double-substituted substrates than the single-substituted ones. These hydrolases could potentially play important roles in the degradation and utilization of hemicellulosic biomass by S. fibuligera.
Heterologous secretory expression of endoglucanase E (Clostridium thermocellum) and ${\beta}$-glucosidase 1 (Saccharomycopsis fibuligera) was achieved in Saccharomyces cerevisiae fermentation cultures as an ${\alpha}$-mating factor signal peptide fusion, based on the native enzyme coding sequence. Ethanol production depends on simultaneous saccharification of cellulose to glucose and fermentation of glucose to ethanol by a recombinant yeast strain as a microbial biocatalyst. Recombinant yeast strain expressing endoglucanase and ${\beta}$-glucosidase was able to produce ethanol from ${\beta}$-glucan, CMC and acid swollen cellulose. This indicates that the resultant yeast strain of this study acts efficiently as a whole cell biocatalyst.
발효된 황매화의 상업적 사용 가능성을 확인하기 위하여 항산화능 실험과 세포 독성, 항염능 실험을 실시하였다. 항산화능 실험에는 DPPH 실험, ABTS 실험, polyphenol 농도 측정, flavonoid 농도 측정을 실시하였다. polyphenol과 flavonoid 농도 측정에서는 발효군이 대조군에 비해 높은 농도를 나타내어, 발효를 통해 추출물의 유효성분 및 추출 수율을 높인다는 것을 확인하였다. DPPH, ABTS에서는 대조군에 비해 발효군의 항산화능이 높은 것을 확인하였다. 이는 S. fibuligera가 발효 과정에서 생산해 낸 효소에 의해 황매화의 세포벽 연화와 유기산과 에탄올 생성에 의한 추출 수율 증가에 의한 요인으로 생각된다. 항염능 실험에서는 세포 독성과 항염능을 알아보았다. 세포독성의 경우 대조군과 발효군 모두 낮은 세포독성을 보였으며, 염증 전달 물질인 NO 생성 억제능의 경우 발효군이 대조군에 비해 통계적으로 유의한 수준의 항염능 증가를 보였다. 염증성 cytokine인 IL-1β, IL-6의 농도를 측정한 결과 200 ㎍/mL 농도에서 각각 48.1±6.2%, 30.4±2.2%의 억제효과를 나타내었다. 이를 통해 발효 황매화가 염증 억제를 위한 물질로서 사용가능함을 보였다.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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