2004년부터 2005년까지 제주도에서 전형적인 연쇄구균증상을 나타내는 양식넙치로부터 Streptococcus sp.를 분리하였다. 생화학적 성상 조사와 multiplex PCR assay법을 통해 S. iniae 94 균주를 동정하였다. RAPD fingerprint profile을 조사해 본 결과 A, B, C-type 총 3가지의 genotype을 확인하였으며, 동일종에 대해 외국에서 보고된 선행 연구결과와 비교하였을 경우, 지리적으로 다른 유전적 다형현상을 나타내는 것으로 추정되었다. 근래에 제주도에 우점하는 genotype은 A-type이었고, RAPD fingerprint profile은 약 2,000 bp, 1,300 bp, 1,000 bp, 850 bp, 550 bp의 밴드 양상을 나타내었다. S. iniae의 serotype 동정에 유효한 것으로 보고되어진 P14 random primer는 유전적 다형현상에 의해 제주도에서 분리된 S. iniae의 serotype 동정에 적합하지 않은 것으로 판단되었다.
본 연구의 목적은 국내 어류 연쇄구균증 병원체 동정에 있어서 Streptococcus iniae에 대한 구체적인 국내 연구 보고가 없어, 기존에 수행되고 있는 동정방법을 근간으로 16S-23S intergenic spacer region (ISR)의 염기서열을 분석하여 보다 명확한 동정을 실시하고자 하였다. API 20 strep system에 의한 생화학적 성상을 분석해본 결과 정확한 종 동정은 이루어지지 않았지만 기존의 연구에서 보고된 API 20 strep system에 의한 S. iniae의 생화학적 성상과 높은 유사성을 보이는 10균주를 분리할 수 있었다. S. iniae 16S rRNA gene 서열 유래 종 특이적 primer Sin-1 5'-CTAGAGTACACATGTACT(AGCT)AAG-3'와 Sin-2 5'-GGATTTTC CACTCCCATTAC-3'에 의한 PCR-assay 결과 시험균주 10 균주 모두 동일하게 약 300bp의 증폭산물이 관찰되었고, 비 특이적인 반응은 관찰되지 않았다. 시험균주 모두 3개의 16S-23S ISR operon 구조가 관찰되었으나 S. iniae 표준균주 (KCTC 3657)의 경우 단일 구조가 관찰되었다. 16S-23S intergenic spacer region (ISR)의 염기서열을 분석해본 결과 기존에 보고된 S. iniae (Genbank accession number AF 048773)와 96%의 상동성을 보였으며 전체서열에서 상동성을 보이는 근연종이나 근연속은 검색되지 않아 최종적으로 S. iniae로 동정하였다.
제주지역 양식 넙치의 주요 세균성 질병의 일종인 연쇄구균증 원인균 Streptococcus iniae 및 Streptococcus parauberis에 대한 생물학적 특성을 시험하였다.온도별 성장 시험결과 S. parauberis 균주는 10℃ 배양조건에서 성장이 이루어졌으나 S. iniae 균주의 경우는 10℃에서는 성장이 확인되지 않았으며, 용혈성 시험결과에서는 S. iniae 균주의 경우에만 β용혈성을 나타내었다.생화학적특성 시험결과 acetoin production test (VP test), hippurate hydrolysis test (HIP test)에서는 S. parauberis 균주의 경우에만 양성반응을 보여 두 균주사이에 뚜렷한 차이를 보였다.또한 α-D-glucose, D-mannose, D-psicose, D-trehalose, pyruvatic acid methyl ester, glycerol은 두 균주 모두 기질로 이용하였으나 L-lactic acid는 S. iniae 균주만이 이용하였고, β-methyl-D-glucoside의 경우는 S. parauberis 균주만이 기질로 이용하는 것으로 나타났다.병원성 시험결과, S. iniae는 급성감염 형태를 보인 반면에 S. parauberis는 만성 감염형태를 보임으로써 차이를 나타내었다.
The potential of Streptococcus iniae glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) as an antigen for a subunit vaccine was investigated using a zebrafish model. The recombinant S. iniae GAPDH was purified using His-tag column chromatography, and antisera against the recombinant GAPDH (rGAPDH) were produced by intraperitoneal immunization of rats. By immunization with S. iniae rGAPDH, the survival rates of zebrafish against an S. iniae challenge increased, suggesting that GAPDH would be an antigen capable of inducing protective immune responses in fish. Furthermore, we demonstrated using Western blotting, that the antisera against rGAPDH of S. iniae had cross-reactivity with GAPDH from Streptococcus parauberis and Lactococcus garviae, which are also culprits of streptococcosis in cultured fish in Korea. These results suggest that S. iniae GAPDH may be used as an antigen for the development of a subunit vaccine against streptococcosis caused by diverse cocci in cultured fish.
Edwardsiella tarda, Streptococcus iniae and S. parauberis are main bacterial pathogens in aquaculture farms of olive flounder, Paralichthys olivaceus. We have discussed the efficacy and safety of 3 type-combined vaccines (A: S. iniae 1mg + S. parauberis 1mg + E. tarda 1mg, B: S. iniae 1mg + S. parauberis 1mg + E. tarda 0.5mg, C: S. iniae 1.5mg + S. parauberis 1.5mg + E. tarda 1mg) through intraperitoneal injections in olive flounder. None of the vaccines gave rise to any signigicant side effects on histopathology and blood chemistry. The antibody titers and lysozyme activities of A type were higher than those of B, C and control. Four weeks after vaccination, RPS (relative percent survival rates) was 62.5~75% (A type), 50~66.7% (B type) and 55.6~62.5% (C type) respectively. As the results, the combined vaccines are possible to prevent edwardsiellosis and streptococcosis, and A type : S. iniae 1mg + S. parauberis 1mg + E. tarda 1mg, is the most effective out of them.
Streptococcus iniae는 대표적인 어류병원균으로 인수공통의 질병을 일으킨다. S. iniae FP5228에 존재하는 병원성 인자를 찾고자 하는 연구과정에서 S. iniae를 24시간 이상 배양한 배양액에는 살아있는 균의 수가 급격하게 감소하는 현상을 발견하였다. 이 현상은 FP5228 균이 가지고 있는 14 kb plasmid 상에 있는 toxin/antitoxin (TA) system의 구성요소인 toxin ${\zeta}$와 antitoxin ${\varepsilon}$ 유전자가 관련이 있을 것이란 가설을 설정하였다. IPTG와 arabinose에 의해 toxin ${\zeta}$와 antitoxin ${\varepsilon}$의 발현이 조절되는 pBP1140 vector system을 구축하였다. E. coli/pBP1140 균주는 toxin이 발현되는 조건에서 초기 생육이 느려졌고, 현미경의 관찰에서 균체가 길어짐을 확인하였다. FP5228 균주가 가진 14 kb plasmid를 없앤 S. iniae CK287을 제조하였다. CK287 균은 배양 중 급격하게 사멸되는 현상을 보이지 않았고, biofilm 생성능력도 감소하였고 세포독성 시험과 물고기 시험에서 독성이 약화 된 것이 확인되었다. 이들 결과 들은 TA system이 생리적 조절 및 병원성 인자의 발현에 관련이 있음을 추정할 수 있다.
제주지역 양식넙치의 주요 세균성 질병의 일종인 연쇄구균증 발병동향과 특성을 분석하였다. 제주지역 양식넙치의 연쇄구균증은 연중 발생하는 양상을 보였으나 상대적으로 고수온기에 발생율이 높았으며, 30cm 이상의 개체에서 주로 관찰되었다. 2003년 6월부터 2005년 5월 사이에 분리된 연쇄구균 균주를 multiplex PCR assay 기법을 이용하여 종 조성을 분리한 결과 Streptococcus iniae와 S. parauberis로 동정되었으며 그 비율은 각각 46%와 54%이었다. S. iniae는 상대적으로 9월과 10월에 높은 분리율을 나타내었으나 S. parauberissms 3월과 4월에 분리율이 높게 나타났다. S. iniae와 S. parauberis 감염개체의 병리학적 중상은 일부분 유사하였으나 S. iniae 분리개체는 복부팽만, 탈장, 복수저류증상이 주로 관찰되는 반면, S. parauberis 분리개체는 체색흑화, 무안측 발적 중상이 두드러지게 관찰되었다. 이 두 종의 병원체 모두 ampicillin과 amoxicillin에 감수성이 높았으며, S. iniae 균주들은 S. parauberis 균주들보다 상대적으로 doxycycline, erythromycin, oxytetracycline에 감수성이 높았다.
본 연구는 넙치, Paralichthys olivaceus에서 Edwardsiella tarda와 Streptococcus iniae에 대한 혼합백신의 효능과 안전성에 대해 조사하고자 하였다. 혼합백신을 주사한 넙치에서 2, 4, 6, 8주 째에 채혈하여 E. tarda와 S. iniae에 대한 항체가 를 microtitre 법으로 조사하였다. 백신 주사 후 3주째에 E. tarda와 S. iniae를 각각 인위감염 시켰을 때 백신구에서 81.0-92.8%의 높은 상대생존율을 보여 혼합백신에 의한 항병력의 증가가 확인되었다. 백신 주사 후 초기에 백신구가 대조구에 비해 체중 증가가 느렸으나 사육기간이 길어지면서 회복되어 대조구와 백신구 체중의 차이를 보이지 않았다. 이 결과는 백신 주사가 넙치의 성장에 영향을 주지 않고 에드와드병과 연쇄구균증을 예방할 수 있음을 보여준다.
Antibacterial activity of 80% methanol extract from 13 commercial herb medicines was measured against fish pathogens Streptococcus iniae, causing several diseases in various kind of fish. Siegesbeckia pubescens showed the strongest antibacterial activity against S. iniae. Methanol extract of S. pubescens was further extracted using several organic solvents having different polarity. Extract from n-hexane and ethyl acetate fraction showed strong activity. Minimal inhibitory concentration, MIC of S. pubescens extract was measured and resulted showing 8 μg/mL with n-hexane fraction and 32 μg/mL with ethyl acetate fraction against S. iniae. The growth of S. iniae was fully inhibited by adding 50 μg/mL (final concentration) of n-hexane or ethyl acetate fraction in the liquid media. It is needed that, from these results, purification and isolation of responsible active compound(s) of these activities and further study on the synergy effect using combination with commercial antibiotics against fish pathogenic bacteria.
The purpose of this study is to explore the possibility of essential oils and flavonoids improving the performance of antibiotics, proving a higher efficacy in the presence of natural substances against Edwardsiella tarda and Streptococcus iniae. Increased efficacy was observed in several cases: both essential oils and flavonoids increased antibacterial efficacy of oxytetracycline and flumequine against E. tarda by 2-fold; essential oils and flavonoids increased antibacterial efficacy of nalidixic acid against E. tarda by 4-fold; flavonoids increased antibacterial efficacy of josamycin against S. iniae by 4-fold. The results obtained in this study suggest that essential oils and flavonoids might be especially useful in increasing the antimicrobial activity of nalidixic acid and josamycin against E. tarda and S. iniae in fish. Natural compounds examined in this study could also be useful to help decrease the overuse of antibiotics in fish.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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