• 농업과학연구
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• 제16권2호
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• pp.225-238
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• 1989

동양배(신고(新高))에서 protease를 추출(抽出), 정제(精製)하여 그의 특성(特性)을 검토(檢討)한 결과(結果)는 다음과 같다. 1. 배의 protease는 배의 과육(果肉)-정량(定量)과 5mM의 cysteine, 40mM 2-mercaptoethanol 및 2mM의 EDTA를 함유(含有)하는 0.1M-sodium phosphate buffer(pH6.5)0.7배량(倍量)(v/w)을 homogenizer에 넣고 10,000rpm으로 5분간(分間) 추출(抽出)하는 것이 효과적(效果的)이었다. 2. 상기(上記) 방법(方法)에 의(依)해서 파쇄(破碎)한 것을 cheese cloth로 여과(濾過)하여 10,000g로 20분간(分間) 원심분리(遠心分離)하여 얻어지는 상징액(上澄液) 조효소액(粗酵素液)으로 하여 유안(硫安) 분획(分劃), Sephadex G-100 filtration 및 DEAE-Sephadex A-50 column chromatography를 거쳐 전기영동상(電氣泳動上)으로 단일(單一)한 효소단백질(酵素蛋白質)을 얻었다. 3. 정제효소(精製酵素)의 비활성(比活性)은 10.78배(倍) 증가(增加)하였고, 활성수율(活性收率)은 722%에 달(達)하였다. 4. 정제효소(精製酵素)의 분자량(分子量)은 SDS전기영동법(電氣泳動法)에 의(依)하여 측정(測定)하였을 때 51,000이었으며, Km값은 $54.5mg/m{\ell}$이었다. 5. 본(本) 효소(酵素)의 작용(作用) 최적(最適) pH는 6.0이었고, pH5.5~6.5에서 안정(安定)하였으며, 작용(作用) 최적(最適) 온도는 $50^{\circ}C$이고, $50^{\circ}C$ 이하(以下)에서 안정(安定)하였다. 6. 본(本) 효소(酵素)는 casein을 가장 잘 분해(分解)하였고 hemoglobin 분해력(分解力)은 casein분해력(分解力)의 55%에 달(達)하였으며, elastin분해력(分解力)은 극(極)히 미약(微弱)하였다. 7. 본(本) 효소(酵素)는 p-chloromercuribenzoic acid에 의(依)해서는 강(强)한 저해(沮害)를 받았고, $HgCl_2$, $MnSO_4$에 의(依)해서도 저해(沮害)를 받았으나 cysteine등(等)의 각종(各種) 환원제(還元劑), EDTA, phenylmethylsulfonyl fluoride 및 N-tosyl-L-phenylalanine chloromethyl ketone에 의(依)해서는 저해(沮害)를 받지 않았다.

• 한국수산과학회지
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• 제34권4호
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• pp.370-377
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• 2001

본 연구에서는 넙치, Pafalichthys olivaceus 뇌 조직에서 인지질가수분해효소 D (phospholipase D, PLD) 활성의 특성 규명 및 이 활성을 억제하는 단백질을 분리 정제하여 그 특성을 규명하였다. 넙치 뇌 조직에서 PLD 활성이 관찰되었으며, 이 활성은 포스파티딜 이노시톨 비스인산염 (phosphatidyl-inositol 4,5-bisphos-phate, $PIP_2$)에 대해서 의존성을 나타내었으나, ADP-rebosylation factor (ARF)에 의해서는 영향을 받지 않았다. PLD 억제물은 넙치 뇌 조직의 세포질 분획물을 사용하여 여러 종류의 칼럼을 통하여 분리 정제하였고, 그 억제물의 분자크기 및 기작의 특성을 규명하였다. 마지막 chromatography을 통하여 여섯 개의 억제를 나타내는 분획물을 얻었으며, 이 중 두 개의 분획물인 IIA IIB는 $PIP_2$-phosphatase activities를 나타내었다. 이 중 IIA 분획물은 면역화학적 분석을 통하여 inositolpolyphosphate 5-phosphatase family로 알려져 있는 신경말단 단백질인 synaptojanin으로 동정되었다. 그리고 IIB fraction은 Superose 12 gel filtration chromatography을 통하여 158-kDa의 크기로 확인되었으며, 이것은 면역화학적 분석을 통하여 synaptojanin과는 별개의 단백질로 판명되었다. 또한, IIB 분획물은 $PIP_2$ phosphatase activity 확인 실험에서 대사산물로서 phosphatidylinositol phosphate (PIP)만을 생성하였다. 이 결과는 IIB 분획물이 $PIP_2$의 4혹은 5 위치의 인산 (phosphate) 중 어느 하나만을 선택적으로 가수분해시킨다는 것을 암시한다. 이상의 연구 결과들을 종합하여 보면, 넙치 뇌 조직에는 다양한 형태의 $PIP_2$-phosphatases가 존재하며, 이들은 $PIP_2$-의존적인 PLD 활성의 억제조절과정에서 중요한 역할을 할 것으로 사료된다.

• Applied Biological Chemistry
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• 제22권4호
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• pp.191-197
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• 1979

Km값 및 분광학적성질(分光學的性質)를 조사하고 아울러 이 효소(酵素)의 결정화법(結晶化法)을 검토하여 다음과 같은 결과를 얻었다. 1. 효소(酵素)의 정제(精製)과정에서 유안분별침전(硫安分別沈澱)을 한 조효소(粗酵素)를 pH6.0 및 7.0의 인산염(燐酸鹽)완충액으로 48시간 이상의 충분한 투석(透析)을 시키고 DEAE-Sephadex column chromatography에서는 11mg protein/ml DEAE-Sephadex 정도의 DEAE-Sephadex를 사용하는 것이 효과적이였다. 2. 효소(酵素)의 정제과정(精製過程)에서 이미 알려진 protamin 황산(黃酸) 처리와 Sephadex G-150의 gel여과는 생략하여도 무방하였다. 3. 효소(酵素)의 결정화(結晶化)에서는 단백질을 20mg/ml의 농도가 되게끔 2-mercaptoethanol를 함유하는 0.01M 인산(燐酸)카리 완충액에 녹여 고체유안(固體硫安) 첨가(添加)법으로 결정(結晶)시키는 것이 가장 큰 육각봉상(六角棒狀)의 결정(結晶)이 얻어졌다. 4. Pyridoxal phosphate와 결합(結合)한 holo형 ${\beta}-tyrosinase$는 340nm와 430nm의 파장(波長)에서 각각 최대흡수(最大吸收)를 나타내었다. 5. ${\beta}-tyrosinase$의 L-tyrosine에 대한 Km값은 $2.31{\times}10^{-4}M$이였으며 SDS-polyacrylamide 전기영동법(電氣泳動法)에 의한 이 효소(酵素)의 subunit의 분자량(分子量)은 약 5,000이였다.

• Journal of Microbiology and Biotechnology
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• 제30권11호
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• pp.1720-1728
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• 2020

We have previously characterized AprESJ4, the major fibrinolytic enzyme from Bacillus subtilis SJ4 (Yao et al., 2019). During that study, we observed a 68 kDa protein with fibrinolytic activity. In this study, we cloned the gene (vprSJ4) encoding the 68 kDa protein, a mature Vpr and minor protease secreted by Bacillus species. vprSJ4 encodes a preproenzyme consisting of 810 amino acids (aa) including signal sequence (28 aa) and prosequence (132 aa). The mature enzyme (650 aa) has a predicted molecular weight of 68,467.35. Unlike Vprs from other B. subtilis strains, VprSJ4 has 4 additional amino acids (DEFA) at the C-terminus. vprSJ4 was overexpressed in Escherichia coli. PreproVprSJ4 was localized in inclusion bodies, and subjected to in vitro renaturation and purification by an affinity column. SDS-PAGE and western blot showed that autoprocessing of preproVprSJ4 occurred and 68 kDa and smaller proteins were produced. The optimum pH and temperature of the recombinant VprSJ4 were pH 7.0 and 40℃, respectively. Kinetic parameters of recombinant VprSJ4 were measured by using an artificial substrate, N-succinyl-ala-ala-pro-phe-p-nitroanilide. Coexpression of vprSJ4 and aprESJ4 using pHY300PLK increased the fibrinolytic activity a further 117% when compared with aprESJ4 single expression using the same vector in B. subtilis WB600.

• 한국식품영양과학회지
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• 제26권2호
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• pp.351-357
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• 1997

Bacillus firmus가 생산하는 cyclodextrin glycosyltran-sferase(CGTase)를 ammonium sulfate 침전, DEAE-Sephadex A-50 및 Sephdex G-100 column chromatography로 분리, 정제하였다. 이 방법으로 수율은 12%, 정제도는 49배인 SDS-PAGE 상에서 단일 band의 효소 단백질을 얻을 수 있었다. 정제된 CGTase는 Phast system의 SDS-polyacrylamide gel 전기영동에 의하여 분자량은 80,000dalton, isoelectric focusing으로 등전점은 9.6으로 추정되는 단백질이었다. 이 효소의 최적 활성 pH와 온도는 8.0, $65^{\circ}C$이였으며, pH와 열안정성은 $pH\;5.5{\sim}9.0$, $50^{\circ}C$이였다. Soluble starch를 기질로 하여 24시간 효소반응한 액의 ${\alpha}-\;:\;{\beta}-\;:\;{\gamma}-cyclodextrin$의 생성비율은 0.01 : 2.90 : 1.00으로 ${\beta}-$ 및 ${\gamma}-cyclodextrin$을 주로 생산하였다.

• 한국미생물·생명공학회지
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• 제31권3호
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• pp.216-223
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• 2003

새롭게 분리된 Bacillus cereus H-1으로부터 크기가 45-kDa인 chitosanase를 정제하여 특성을 파악하였고 1.3-kb의 chitosanase 유전자(choA)를 대장균에 클로닝하여 발현시켰다. H-1의 chitosanase 단백질(ChoA)은 ammonium sulfate 침전과 CM-sephadex칼럼 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 최적 pH는 약 7이었고 pH 안정성은 $50^{\circ}C$에서 4-11로 나타났다. 최적 온도는 약 5$0^{\circ}C$였으며 효소 활성은 $45^{\circ}C$ 아래에서 비교적 안정하였다. H-1 chitosanase는 soluble 또는 glycol chitosan뿐만아니라 carboxymethyl cellulose(CMC)에 대한 활성도 나타내었다. 정제된 ChoA의 MALDI-TOF MS분석에 기초하여 이미 알려진 다른 Bacillus chitosanases와의 데이터베이스 검색을 통해 전체 아미노산 서열을 밝혀내었다. Chitosanase gene에 해당하는 1.6 kb의 PCR 산물을 얻었으며 그의 DNA 서열을 결정하였다. choA의 추정 아미노산은 Bacillus sp. No 7-M과 Bacillus sp. KCTC0377BP의 아미노산과 98%의 유사성을 나타내었다. 재조합 ChoA단백질은 E. coli DH5$\alpha$에서 원 균주와 동일한 크기로 발현되었다. N말단의 추정아미노산서열을 다른 chitosanas리 서열과 비교해 볼때 ChoA는 chitosanase-cellulase 활성을 갖는 family 8에 속하는 미생물 endo-chitosanaseT. 추정되었다.

• Applied Biological Chemistry
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• 제22권1호
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• pp.1-9
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• 1979

대두(大豆)의 ${\gamma}-conglycinin$을 정제(精製)하고 그의 물리일(物理一) 화학적(化學的) 성질(性質)을 연구(硏究)하여 다음의 결과(結果)를 얻었다. Gamma-conglycinin은 대두(大豆)의 pH 4.5, 0.2M Nacl 추출액을 Sephadex G-150으로 분리하여 얻은 7S globulin을 DEAE-Sephadex A-50으로 column chromatography하여 정제(精製)하였다. 정제된 ${\gamma}-conglycinin$은 면역전기영동(免疫電氣泳動), polyacrylamide gel 전기영동(電氣泳動)과 gel isoelectric focusing 상으로 순수(純粹)하였다. 등전점(等電點)은 pH 5.4이었으며 질소(窒素) 16.21%, mannose 4.18, glucosamine 1.21%의 함량(含量)이었다. 아미노산 조성(組成)은 일반적(一般的)으로 lysine, dicarboxylic acid와 암모니아태(態) 질소(窒素)의 함량(含量)이 높았고 함황(含黃)아미노산과 tryptophane의 함량(含量)은 낮은 편이었다. Subunit의 등전점(等電點)은 pH $4.5{\sim}5.5$에 분희(分希)하였는데 그중 pH $4.6{\sim}5.0$에 위치(位置)한 것은 분자량(分子量) 38,000의 당(糖) peptide이었으며 pH $5.0{\sim}5.5$의 것은 분자량(分子量) 32,000의 단순(單純) peptide이었다.

• Applied Biological Chemistry
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• 제41권1호
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• pp.6-12
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• 1998

폐단백질을 활용하는 방도의 하나로 폐단백질 자원으로 부터 불용성 단백질의 분리 효율성을 높이고 기능성을 개선하기 위하여 protease를 생산하는 Aspergillus sp. MS-18 균주를 토양으로 부터 분리하고 이 균주가 생산하는 효소를 정제하여 특성을 살펴보았다. 효소 생산을 위한 최적 배양조건은 3% arabinose, 0.5% polypepton, 0.1% ammonium sulfate, 0.1% magnesium chloride 첨가로 3 일 배양이었다. 효소는 ion exchange chromatography, gel filtration 등으로 16.9 배 정제할 수 있었으며 비활성역가는 340.4 unit/mg이었다. 정제효소는 polyacryl amide gel 전기영동상 단일 밴드로 나타났으며, 분자량은 30,000 정도로 추정되었고 결정구조는 모서리가 둥그스럼한 막대 모양이었다. 정제 효소의 최적작용 pH와 온도는 9.0, $60^{\circ}C$였으며, pH 7.0-12.0까지 $50^{\circ}C$에서 안정하였다. 금속이온중 $Na^+$, $Mg^{2+}$, $Mn^{2+}$등에 의해 활성이 증대 되었으나, $Hg^{2+}$, $Cu^{2+}$, $Zn^{2+}$, $Pb^{2+}$에 의해 효소 활성이 저해되었고 저해제중 ethylenediaminetetra acetic acid와 phenyl methanesulfonyl fluoride에 의한 활성 저해가 관찰되어 금속 이온이 효소 활성에 관여하는 serine protease로 추정되었으며 정제효소의 Km, Vmax는 $29.33\;{\mu}mole/L$, $5.13\;{\mu}g/min$이었다.

• Applied Biological Chemistry
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• 제49권1호
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• pp.55-59
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• 2006

본 연구는 게르마늄 강화 효모의 제조 공정을 위한 최적의 조건을 확인하고 제조된 게르마늄 강화 호모 내의 게르마늄 결합 상태 확인을 목적으로 수행하였다. 그 결과 영양소별 최적조건은 글루코스 3.0%, 효모추출물 0.3%, 펩톤 0.5%이었으며, 이 때 생성된 균체량은 67.4 mg/ml이었다. 또한 균체와 게르마늄 용액 혼합 비율은 1 : 0.5(50%), pH는 6.5 및 온도는 $35^{\circ}C$로 배양하는 조건이 높은 함량의 게르마늄을 효모 균체 내로 흡수시켜 게르마늄 강화 효모를 생산하는 것을 가능하게 하였다. 배양 과정을 통해 생산된 게르마늄 강화 효모는 배양 과정동안의 구조적 변화에 의해 효모 내에 흡수된 무기 형태인 $GeO_2$ 게르마늄과는 다른 구조를 나타내었다. 게르마늄 강화 효모는 효모 배양 과정을 통해 인체에 안전한 형태인 천연 유기 게르마늄을 형성하였다. 이는 각종 암, 성인병의 예방과 치료, 인체 면역력의 증진 등 건강 증진을 위한 새로운 기능성 원료로의 활용이 기대되며, 이에 대한 안전성 등의 지속적인 연구가 필요할 것으로 사료된다.

• 한국미생물·생명공학회지
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• 제5권4호
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• pp.177-184
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• 1977

Arylsulfatase는 간단한 Phenols류의 황에스테르 화합물로부터 S $O_{4}$$^{[-992]}$ - 이온의 유리를 촉매한다. 이 효소는 토양센균을 포함한 많은 미생물과 동식물의 조직등에 널리 분포하여 있으며 이와 같은 넓은 분포는 이 효소의 기본적 기능이 환경학적으로 매우 중요한 의미를 갖는다고 하겠다. Arylsulfatase에 대한보고는 Klebsiella sp를 사용하여 몇몇 보고가 있다. 본 연구는 6종의 Serratia sp를 사용하여 arylsulfatase 합성조건을 검토하고 효소의 정제조건과 성질에 대하여 조사하여 Serratia marcescens를 선정하였다. Serratia mrcescens는 탄소원으로서 xylose rhamnose, glucosamine 그리고 arabinose등과 같은 몇몇 당을 이용하지 못했으며 glucose와 mannitol을 잘 이용하였으나 glucose methioniue의 경우 효소 합성을 억제시키었다. 유황원으로서는 무기유황염과 methionine의 첨가는 억제되었으며 tyramine의 첨가에 의해서 효소 함성의 억제효과는 해제되었다. 효소의 정제는 황산암모늄 포화용액의 분획과 DEAE-Cellulose, CM-Cellulose 그리고 DEAE-Sephadex A-25로 연결되는 구분 분획에 의해서 행하여졌다. 효소의 분자량은 SDS-gelelectrophoresis와 Sephadex G-100 column chromatography에 의하여 각각 46,000과 49,000으로 측정되었고 최적 PH는 6.8이었다. P-Nitrophenyl sulfate를 사용한 Km과 Vmak치는 각각 2.5$\times$$10^{4-}$M과 20 nmoles/min/mg protein이었다. 기질에 대한 특성은 phenylsulfte와 ο-, p-nit-rophenyl sulfate 그리고 p-nitro catechol sulfate에 대해서 높은 활성을 보였다. Hydroxylamine, inorganic fluoride, sulfide 그리고 Phosphate등은 강한 효소 저해작용을 나타내었고 무기유산염은 저해작용을 보여주지 않았다. Tyramine, octopamine그리고 dopamine과 같은 amino acid 또한 강한 저해 작용을 보였다.