• 한국미생물·생명공학회지
• /
• 제31권1호
• /
• pp.36-41
• /
• 2003

Saccharomyces cerevisiae로부터 외래 $\alpha$-amylase의 발현 및 분비를 증진시키기 위하여 여러 실험이 수행되었다. ADC1 promoter와 mouse salivary $\alpha$-amylase cDNA gene의 native signal sequence를 효모의 PRB1 promoter와 invertase leader sequence로 대치한 plasmid vector pCNN(AMY)를 제작하였다. 효모세포에서 생성된 $\alpha$-amylase의 세포외로의 분비율은 mouse o-amylase의 native signal sequence인 경우는 약 89.4%이었으며 invertase leader sequence로 치환된 경우는 96.3%로 분비효율이 증진되었다. 야생주인 K8l/pCNN(AMY)와 호흡결여변이주인 K81/pCNN(AMY)p-의 혐기적 조건하에서의 배양 결과 $\alpha$-amylase 생산량이 K8l/pCNN(AMY)보다 K81/pCNN(AMY)p-가 약 5~8배 정도 증가하였다. $\alpha$-Amylase의 생산에 있어서 배지조성에 따른 K81/pCNN(AMY)의 생산증진의 비교는 배지성분인 yeast extract와 peptone의 구성비율을 비교하였을 때 yeast extract 1%와 peptone 2%, NaCl의 경우 100 mM, 2-mercaptoethanol인 경우에는 0.015%(w/v)을 첨가하였을 때 최대 효소 활성을 나타내었고, 특히 2-mercaptoethanol인 경우에는 대조구에 비해 효소 생산량이 약 3배 정도 증진되었다.

• BMB Reports
• /
• 제28권4호
• /
• pp.368-373
• /
• 1995

The upstream regulatory region (URR) of bovine papillomavirus type 1 (BPV) contains promoters and a conditional transcriptional enhancer that is trans-activated by the viral E2 protein. After deleting the 5' and 3' ends of BPV URR, BamHI linkers were inserted into several positions of BPV URR without causing an addition or a deletion of URR sequences. Most linker scanning mutations did not show any effects on the transcription of P7940 and P89 promoters in BPV URR. However, several mutants showed reduced transcriptional activities. Based on our results we found that the AP-2 and Sp1 binding sites were important for basal level transcription of BPV URR in the absence of the E2 protein and that the CTF/NF-1 site is dispensable for E2 transactivation of BPV URR transcription.

• 한국미생물·생명공학회지
• /
• 제26권1호
• /
• pp.68-75
• /
• 1998

A. niger의 GOD(Glucose Oxidase) 대량생산과 효율적인 분비를 protein의 대량생산에 많이 사용되는 strain인 S. cerevisiae에서 시도하였다. S. cerevisiae의 ADH1과 GAL 10 promotor, 그리고 ${alpha}$-MF signal sequence와 A. oryzae의 ${alpha}$-amylase signal sequence 및 S. cerevisiae의 GAL7과 A. niger의 GOD terminator를 이용하여 4개의 expression vector를 합성한 후 S. cerevisiae 2805에 auxotroph 방법으로 형질변환시켰다. 변이체들을 배양하여 세포내와 세포외의 GOD활성도를 분석한 결과 GAL 10 promotor가 삽입된 pGAL변이체들이 ADH1 promotor가 삽입된 pADH 변이체들 보다 GOD 생산성이 높았다. GAL 10 promotor와 A. oryzae의 ${alpha}$-amylase signal sequence가 삽입된 pGALGO2에서 115시간 배양시 GOD의 생산이 가장 높았다($GOD_{total}$: 10.3 unit/mL, $GOD_{ex}$: 8.7 unit/mL). 이 수치는 같은 promotor인 GAL 10 promotor와 ${alpha}$-MF signal sequence가 삽입된 pGALGO1보다 3배정도 높다. 이 결과는 ADH 1 promotor를 사용하였을 경우에도 일치하였다. 또한 A. oryzae의 ${alpha}$-amylase signal sequence가 S. cerevisiae의 ${alpha}$-MF signal sequence보다 GOD를 더 효과적으로 분비시켰다. 상기 결과로 미루어 보면 signal sequence가 단백질의 분비 외에도 단백질 합성에도 많은 영향을 주는 것으로 추측된다. pGALGO1과 pGALGO2의 GOD분비효율은 각각 89%, 84%이었다. S. cerevisiae에서는 일반적으로 과당화가 일어나기 때문에 S. cerevisiae에서 합성된 재조합 GOD의 분자량은 250 kDa으로 A. niger의 GOD(170 kDa)보다 더 컸다.

• KSBB Journal
• /
• 제10권1호
• /
• pp.89-96
• /
• 1995

A rabidopsis thaliana의 trpl 변이 식물체는 uv 하에서 푸른 형광 빛을 발하며, phosphoribosyl anthranilate transferase를 encoding하는 유전자가 결여되어 있다. 이 유전자를 PATl이라고 하며, 많 은 미 생물에서 phospho ribosyl anthranilate trans ferase와 homologous하다. 트럽토판 생합성에서 이 효소가 결여되면 anthranilate가 축적되며 형광 빛 을 발하게 된다. PATl 의 유전자 조절을 알아보기 위하여, PATl 유전자의 promoter를 단계 별로 삭제하여 트립토판 변이 식물체의 형질전환과 재분화를 시도하였다. 이 러한 유전자 조작을 통하여 이 유전자의 발현 양상을 조절하는 promoter 요소와 작용을 확인할 수 있으리라고 생각된다. 또한 PAT의 항체를 사용한 Immunoassay를 통하여 형질전환체 의 단백질 양의 변화를 분석한 결과 PATl의 완전 한 promoter를 가진 pHSI07의 형질전환체는 대조구보다 2배의 단백질 양을 나타냄으로서 2쌍의 PAT 유전자가 발현되었음을 알 수 있었다. PATl 은 selection marker와 reporter 유전자로서 분자유 전학연구에 공헌할 수 였으리라고 생각된다.

• 미생물학회지
• /
• 제40권2호
• /
• pp.81-86
• /
• 2004

Streptomyces coelicolor의 전 유전체 청보를 분석한 결과(7), 유전자 ID1103135가 코드 하는 open reading frame SCO7697이 phytase[myo-inositol hexakisphosphate phosphohydrolase상동성 (3-6,8,23)]에 유의하게 유사한 것으로 판단되었다. S. coelicolor A3(2)M의 염색체 DNA를 주형으로 PCR 방법으로 SCO7697 전체를 포함하는 DNA 단편을 클로닝하였다. 두 가지의 서로 다른 길이를 갖는 클로닝 된 ID1103135 DNA 단편을 E. coli 발현용 벡터pET728a(+)에 삽입하여,두 종의 재조합 벡터 pET28-SP와 pET28-LP를 얻었다. pET28-SP 와 pET28-LP를 각각 E. coli BL2l에 도입하여, IPTG로 발현 유도된 단백질을 SDS-polyacrylamide 전기영동으로 확인한 결과, 발현은 성공적으로 이루어 졌으나 대부분불용체를 형성하고 분자량은 예상보다 약간 큰 것으로 나타났다. 불용체 형성은 단백질의 불활성화를 수반 함으로서, 배양 온도를 $37^{\circ}C$에서 $30^{\circ}C$로 변화시켜 배양하는 방법으로 발현된 단백질을 가용화 시켰다. 발현된 단백질을 추출하여 조추출물 또는 정제한 상태로 phytase활성을 측청하였으나 효소활성은 관찰할 수 없었다. 대장균 시스템에서의 발현이 효소 활성의 소실을 초래했을 가능성이 있으므로, ID1103135 유전자를 자신의 promoter를 함유하도록 PCR 클로닝하여, E. coli - Streptomyces의 shuttle vector인 pWHM3에 삽입하고, 이를 방선균 호스트인 S. lividans에 도입하였다. 형질 전환체의 세포조추출액 및 세포배양액의 phytase 활성을 측청하였으나, 역시 활성을 확인할수 없었다. 이와 같은 결과는 SCO7697이 아주 높은 확률(E value; $6e^{-89}$)로 phytase일 것으로 annotation 되었으나, 실제는 이와는 다른 기능을 함유하고 있음을 시사하고 있다.

• 미생물학회지
• /
• 제48권2호
• /
• pp.141-146
• /
• 2012

Paenibacillus woosongensis의 유전체 부분 염기서열로부터 유추된 xylanase 유전자를 PCR 증폭하여 대장균에 클로닝하였다. Xylanase 유전자는 211 아미노산으로 구성된 단백질을 코드하며 633 뉴클레오티드로 이루어졌다. 아미노산 잔기배열을 분석한 결과 xylanase는 glycosyl hydrolase family 11에 속하며 Paenibacillus의 xylanase와 85-89% 상동성을 보였다. Xylanase 유전자를 T7 promoter로 과잉발현한 결과 그 발현량이 높지 않았으며, 균체내 외에서 모두 효소활성이 관찰되었다. 재조합 대장균의 균체파쇄상등액을 사용하여 효소 반응특성을 조사한 결과 pH 5.5와 $60^{\circ}C$에서 최대 반응활성을 보였다. 한편 xylanase의 기질로 xylan과 xylooligosaccharides를 사용하였을 때 xylose와 xylotriose가 주된 최종 반응산물로 관찰되었으며 xylobiose는 분해하지 못하였으나 이보다 중합도가 큰 xylooligosaccharides는 분해하였다.

• Molecules and Cells
• /
• 제21권2호
• /
• pp.237-243
• /
• 2006

Brain-derived neurotrophic factor (BDNF) is a neuromodulator of nociceptive responses in the dorsal root ganglia (DRG) and spinal cord. BDNF synthesis increases in response to nerve growth factor (NGF) in trkA-expressing small and medium-sized DRG neurons after inflammation. Previously we demonstrated differential activation of multiple BDNF promoters in the DRG following peripheral nerve injury and inflammation. Using reporter constructs containing individual promoter regions, we investigated the effect of NGF on the multiple BDNF promoters, and the signaling pathway by which NGF activates these promoters in PC12 cells. Although all the promoters were activated 2.4-7.1-fold by NGF treatment, promoter IV gave the greatest induction. The p38 mitogen-activated protein kinase (MAPK) inhibitor, SB203580, phosphatidylinositol 3-kinase (PI-3K) inhibitor, LY294003, protein kinase A (PKA) inhibitor, H89, and protein kinase C (PKC) inhibitor, chelerythrine, had no effect on activation of promoter IV by NGF. However, activation was completely abolished by the MAPK kinase (MEK) inhibitors, U0126 and PD98059. In addition, these inhibitors blocked NGF-induced phosphorylation of extracellular signal-regulated protein kinase (ERK) 1/2. Taken together, these results suggest that the ERK1/2 pathway activates BDNF promoter IV in response to NGF independently of NGF-activated signaling pathways involving PKA and PKC.

• Asian Pacific Journal of Cancer Prevention
• /
• 제15권3호
• /
• pp.1181-1186
• /
• 2014

Sialyltransferase gene expression is altered in several cancers, including examples in the cervix. Transcriptional regulation of the responsible genes depends on different promoters. We aimed to determine the association of single-nucleotide polymorphisms in the B3 promoter of the ST3GAL4 gene and the P1 promoter of the ST6GAL1 gene with cervical premalignant lesions or cervical cancer. A blood sample and/or cervical scrapes were obtained from 104 women with normal cytology, 154 with premalignant lesions and 100 with cervical cancer. We also included 119 blood samples of random donors. The polymorphisms were identified by sequencing from PCR products. For the B3 promoter, a fragment of 506 bp (from nucleotide -408 to +98) was analyzed, and for the P1 promoter a 490 bp (-326 to +164) fragment. The polymorphism analysis showed that at SNP rs10893506, genotypes CC and CT of the ST3GAL4 B3 promoter were associated with the presence of premalignant lesions (OR=2.89; 95%CI 1.72-4.85) and cervical cancer (OR=2.23; 95%CI 1.27-3.91). We detected only one allele of each polymorphism in the ST6GAL1 P1 promoter. We did not detect any genetic variability in the P1 promoter region in our study population. Our results suggest that the rs10893506 polymorphism -22C/T may increase susceptibility to premalignant and malignant lesions of the cervix.

• Journal of Microbiology and Biotechnology
• /
• 제14권3호
• /
• pp.593-598
• /
• 2004

The arsenical resistance (ars) operon was cloned from a 67-kilobase pair (kb) plasmid, which was previously shown to be responsible for arsenic salts resistance in K. oxytoca D12. When plasmid pAE48, carrying the ars operon, was transformed into E. coli, transformed cells displayed enhanced survival in the presence of 4 mM arsenite, 50 mM arsenate, or 0.4 mM antimonite. The nucleotide sequence of the 5.6-kb fragment encoding arsenical resistance revealed five open reading frames (ORFs), which were predicted to encode polypeptides of 12.8 (arsR), 13.4 (arsD), 62.6 (arsA), 45 (arsB), and 16.7 (arse) kilodaltons (kDa). Each ORF was preceded by a ribosome binding site. A putative promoter-like sequence was identified upstream of arsR, and a possible termination site was found downstream of arsC. When the deduced amino acid sequences of the K. oxytoca Dl2 Ars proteins were compared with the amino acid sequences of the E. coli R773 Ars proteins, a significant amino acid similarity was observed (87.9％ for ArsR, 89.2％ for ArsD, 83.2％ for ArsA, 92.6％ for ArsB, and 91.3％ for ArsC), suggesting an evolutionary relationship of the ars genes of E. coli plasmid R773 and K. oxytoca Dl2.

• 농업과학연구
• /
• 제23권1호
• /
• pp.80-89
• /
• 1996

본 연구에서는 인간에게 유용한 여러 생리적 기능을 갖는 Human lactoferrin (hLf)을 대량생산할 목적으로 동물 세포의 단백질을 안정하게 생산 및 분비할 수 있는 진핵생물인 효모 sacduraromyces diastaticus YIY345에 hLf 유전자를 도입하여 hLf의 발현 및 분비를 시도하였다. 1. hLf의 발현 및 분비를 위하여 STA1 (S. diasticus glucoamylase) 유전자의 promoter 및 분비 신호와 hLf 전사 종결을 위한 GAL7(galactose utilizing gene) transcriptional terminator하에 재조합 plasmid pYEGLf를 제작하였다. 2. 제작한 plasmid를 선별하고 증폭하기 위하여 대장균에 형질 전환하였고 대장균 형질전환체로부터 plasmid를 분리하여 적당한 제한 효소로 처리하고 크기를 확인하였다. 최종적으로 선별된 plasmid는 효모 S. diastaticus YIY345에 형질 전환시켜 효모 형질전환체를 얻었다. 3. 효모 형질전환체를 Western hybridization으로 단백질 수준에서 분석한 결과 pYEGLf가 도입된 형질전환체에서 hLf가 생산되어 세포외로 분비되었다. 4. hLf가 발현된 효모 형질전환체의 배양상등액을 paper disc법을 이용하여 E.coli에 대한 항균 효과를 측정하였으나 관찰할 수 없었다. E.coli에 대한 hLf의 MIC (minimal inhibitory concentration)는 약 $3000{\mu}g/m{\ell}$에 비해 효모에서 분비하는 hLf의 양은 상당히 적으므로 항균효과를 측정하기 불가능하다. 그러므로 정제 단계를 거쳐 더 높은 농도로 처리해야 할 것이다.