Functional Analysis of Gene ID1103135 Encoding a 3-Phytase Precursor Homologue of Streptomyces coelicolor

Among the annotated ORFs of Streptomyces coelicolor, SCO7697 was supposed to encode for phytase (myo-inositol hexakisphosphate phosphohydrolase). The DNA fragment containing SCO7697 was cloned by the PCR from the chromosomal DNA of S.coelicolor A3(2)M. The cloned fragment was introduced into E. coli expres-sion vector, pET28a(+), to yield two recombinant plasmids, pET28-SP and pET28-LP, which were designed to encode different length of proteins. When the pET28-SP and pET28-LP were introduced into E. coli BL21, the transformants successfully overexpressed recombinant proteins, but the molecular weights of the expressed pro-teins were appeared bigger than those of expected in SDS-polyacrylamide gel electrophoresis. The shift of cul-tural temperature from 37 to $30^{\circ}C$ made most of expressed protein be solubilized. The expressed protein, however, did not show any phytase activity. When the DNA fragment with its own promoter placed on the E. coli-Streptomyces vector, pWHM3, and introduced into S. lividans, the phytase activity was not detected either. These results suggest that even though the SCO7697 was annotated as a probable phytase with high probability (E value is $6e^{-89}$), the real product doest not have phytase activity.

Streptomyces coelicolor의 3-Phytase 상동성 유전자 ID1103135의 기능분석

Streptomyces coelicolor의 전 유전체 청보를 분석한 결과(7), 유전자 ID1103135가 코드 하는 open reading frame SCO7697이 phytase[myo-inositol hexakisphosphate phosphohydrolase상동성 (3-6,8,23)]에 유의하게 유사한 것으로 판단되었다. S. coelicolor A3(2)M의 염색체 DNA를 주형으로 PCR 방법으로 SCO7697 전체를 포함하는 DNA 단편을 클로닝하였다. 두 가지의 서로 다른 길이를 갖는 클로닝 된 ID1103135 DNA 단편을 E. coli 발현용 벡터pET728a(+)에 삽입하여,두 종의 재조합 벡터 pET28-SP와 pET28-LP를 얻었다. pET28-SP 와 pET28-LP를 각각 E. coli BL2l에 도입하여, IPTG로 발현 유도된 단백질을 SDS-polyacrylamide 전기영동으로 확인한 결과, 발현은 성공적으로 이루어 졌으나 대부분불용체를 형성하고 분자량은 예상보다 약간 큰 것으로 나타났다. 불용체 형성은 단백질의 불활성화를 수반 함으로서, 배양 온도를 $37^{\circ}C$에서 $30^{\circ}C$로 변화시켜 배양하는 방법으로 발현된 단백질을 가용화 시켰다. 발현된 단백질을 추출하여 조추출물 또는 정제한 상태로 phytase활성을 측청하였으나 효소활성은 관찰할 수 없었다. 대장균 시스템에서의 발현이 효소 활성의 소실을 초래했을 가능성이 있으므로, ID1103135 유전자를 자신의 promoter를 함유하도록 PCR 클로닝하여, E. coli - Streptomyces의 shuttle vector인 pWHM3에 삽입하고, 이를 방선균 호스트인 S. lividans에 도입하였다. 형질 전환체의 세포조추출액 및 세포배양액의 phytase 활성을 측청하였으나, 역시 활성을 확인할수 없었다. 이와 같은 결과는 SCO7697이 아주 높은 확률(E value; $6e^{-89}$)로 phytase일 것으로 annotation 되었으나, 실제는 이와는 다른 기능을 함유하고 있음을 시사하고 있다.