• Current Research on Agriculture and Life Sciences
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• 제10권
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• pp.137-145
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• 1992

본 연구에 사용한 시료는 형성층 유래의 캘러스를 0.01mg/${\ell}$ 2, 4-D, 0.5mg/${\ell}$ BAP, 3% sucrose, 0.75% 한천을 첨가한 MS배지에서 재분화 시킨 개체를 이용하였다. 시료의 대량증식은 1.0mg/${\ell}$ BAP를 첨가한 MS 배지에서 실시하였으며 엽전개는 식물생장조절제가 첨가되지 않은 MS배지로 옮겨서 실행하였다. Agrobacteria를 이용한 형질 전환은 엽절편, 절간조직등을 박테리아를 묻힌 침으로 자극하여 식물체 분화를 유도하였다. 그 결과 엽절편 조직에서는 분화된 식물체를 얻지 못했으나, 절간조직의 측아에서는 49%에 달하는 24개체가 분화되었다. 이들 분화된 줄기는 kanamycin이 100mg/${\ell}$이 함유된 선발 배지에서 일차적인 선발을 하여 최종적으로 GUS 유전자 검정을 한 결과 처음에 접종한 50개체중 형질전환 된 것으로 추정되는 5개체를 얻어서 형질 전환 추정 비율은 10%에 달한 것으로 나타났다.

• Journal of Plant Biotechnology
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• 제30권4호
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• pp.335-339
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• 2003

pSK109를 포함하고 있는 Agrobacterium LBA4004을 통하여 국화 'Shuho-no-chikara'에 LEAFY 유전자을 도입하였다. 엽절편체의 생존율은 kanamycin 10mg/L가 첨가된 배지에서 생존율 약 22%, 절편체의 재분화율이 10%정도였다. 그러나 kanamycin 20mg/L가 첨가된 배지에서는 엽절편은 약 5%정도 생존하였으나 전혀 재분화가 나타나지 않았다. 따라서 kanamycin 10mg/L를 1차 선발배지로, 20mg/L를 2차 선발배지로 선발하였다. Agrobacterium LBA4404와 국화 엽절편체를 3일간 공동배양 하는 것이 형질전환에 효과적이었다. LEAFY유전자가 삽입된 pSK109 vector를 포함한 Agrobacterium LBA4404의 형질전환 효율은 2차 선발까지 약 2.8% 였으며, Southern blot한 결과 0.13%만이 형질 전환체로 확인되었다. 형질 전환체 한계통은 포장에서 약 1주일 정도 조기개화하였고 화형은 정상이었다.

• 한국자원식물학회지
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• 제18권1호
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• pp.15-21
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• 2005

염류내성 식물은 염류농도의 변화에 따라 세포내의 삼투압을 유지하기 위한 화합물을 합성하는 기작을 가지고 있는데 이런 화합물은 주로 proline, glycine, betaine, polyols, sugar등으로 체내에 축적함으로서 고농도의 염류에 견디는 것으로 알려져 있다. Betaine은 미생물에서 2단계 반응을 통해 choline에서 합성되는데, 첫단계는 choline dehydrogenase (CDH)에 의해서 촉매되고(Bet A gene), bet B 유전자의 산물인 betaine aldehyde dehydrogenase(BADH)에 의해 수행된다. 본 실험에서는 Bet A, Bet B 유전자를 아그로박테리움에 도입하여 새로운 conjugants 2 종을 획득하였으며 (Agrobacterium tumefaciens MP90/pBet A, Agrobacterium tumefaciens MP90/pBet B), 먼저 재조합된 binary vector가 식물에서 발현 및 형질 전환되는지 여부를 조사하기 위해서 이미 담배에 형질전환을 시켰으며, 형질전환된 담배에서는 ,고농도의 kanamycin배지에서 생장이 가능하였고, PCR에 의하여 NPT II, Bet A, Bet B gene를 조사한 결과 담배 유식물체 모두 band가 형성되어 형질전환체임을 확인할 수 있었다. 인삼에 Beth, BetB gene의 도입은 1M의 mannitol이 함유된 식물호르몬 무첨가 MS 배지에서 단일배 발생방법에 형질전환체를 획득하였으나, 형질전환체의 발생빈도$(12\%)$가 매우 낮았다.

• 한국식물병리학회:학술대회논문집
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• 한국식물병리학회 2003년도 정기총회 및 추계학술발표회
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• pp.79.1-79
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• 2003

Two pathogen-induced hot pepper transcription factors (CaNACl and CapIfl) were introduced into‘MicroTom’tomato by Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation. We used to nptII containing kanamycin resistance gene as a selection marker. Both transformed and non-transformed plants were transferred to pot after rooting test in vitro. To approximate the levels of caNACl transcript in leaves of wild-type and transgenic plants, RNA blots were hybridized with double-stranded full-length CaNACl probe at moderate stringency, Although the relative signal strength for hybridization fluctuated among the samples on different blots, transgenic plant lines N-1, N-2 and N-3 consistently displayed increased levels of CaNACl transcript relative to other transgenic lines and wild-type plants. Of all the transgenic lines examined, line N-7 had the least amount of CaNACl transcript. Role of these transcription factors in pathogen defense will be examined by overexpression in tomato.

• 한국연초학회지
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• 제20권1호
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• pp.40-49
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• 1998

Protoplasts were isolated from mesophyll of tobacco(Nicotiana glauca) transformed with kanamycin-resistant gene (NPT II gene) and potato hairy root callus containing Ri plasmid of Agrobacterium rhiEogenes, and protoplasm fusion was made between the isolated protoplasts. The transgenic tobacco leaf tissue could grow on the media containing high concentrations of kanamycin, but not on the phytohormone-free media. On the other hand, the potato hairy root calli could be cultured on the phytohormone-free media but not on media containing more than 40 ㎍/ml kanamycin. In these conditions, the viability of both protoplasts were above 90%, These selection markers were used for the selection of protoplasts fused between the two, i.e. protoplast fusion was detected using selection media containing 100㎍/ml kanamycin and with no phytohormone. The mixture of 1.0% cellulase, 0.3% macerozyme, and 0.7M mannitol was best for the maximum protoplast production for tobacco, and that of 2.0% cellulase, 2.0% macerozyme, 1.0% dricelase, and 0.5M mannitol for potato. Both tobacco mesophyll and potato callus protoplasts were fused by using PEG solution on the selectable medium. Cell walls were regenerated after 5 days in this medium, and colonies were alive until 4 weeks after cultural, but died after 6 weeks.

• 한국약용작물학회지
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• 제9권2호
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• pp.156-165
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• 2001

현삼의 기내배양에서 낮은 농도의 2,4-D(0.01, 0.1mg/l) 와 TDZ(0.01, 0.1, 2.0mg/l)이 조합처리시 shoot 분화가 좋았으나, 2,4-D의 농도가 높아질수록 TDZ과 조합처리시 shoot 분화가 저조 하였다. 형질전환 확인을 위한 PCR 분석에서 선발표지 유전자로 사용되는 NPT II gene의 확인하였는데 형질전환되지 않은 식물체에서는 나타나지 않는 DNA 절편이 형질전환 식물체에서 나타났으며 kanamycin 50 mg/ l 첨가된 배지에서 선발된 식물체에서 NPT II gene(700bp)이 plant genome 안으로 삽입되었음을 확인하였다. 형질전환 식물체의 항균활성 검정에서는 Asperigillus awamori에 대해 대조구 식물체와 같이 항균성이 없는 것으로 나타났으나 항바이러스성 단백질인 PAP가 도입된 식물체에서는 $IC_{50}$의 값이 Asperigillus awamori에 대해서 각각 $320\;{\mu}g/ml$ 과 $300{\mu}g/ml$, C. herbarum에 대해서도 $IC_{50}$ 값이 $80{\mu}g/ml,\;100{\mu}g/ml$로 높은 항균성을 나타내었다. 형질전환 식물체와 형질전환되지 않은 식물체를 대상으로 SDS-PAGE를 수행하여 본 결과 감염된 형질전환되지 않은 잎과 감염되지 않은 잎에서는 나타나지 않는 30kDa의 분자량을 가지는 새로운 band가 PAP유전자에 의하여 형질전환된 식물체에서 각각 확인되었다. Asperigillus awamori의 경우에 PAP 형질전환체의 단백질을 첨가한 경우 모두 포자가 발아가 억제 되었고 균사생장이 지연되었으며 균사가 생장되더라도 포자와 생장하는 균사가 투명하여졌으며 생장하는 균사의 굵기도 가늘어지는 특성을 나타내었다. 병원균 접종 후 생육조사에 의하면 형질전환 식물체가 초장과 지상부, 지하부의 생체 중에서 모두 형질전환 되지 않은 식물체보다 다소 높게 나타났다. Fusarium에 의한 전형적인 병징인 뿌리썩음 병과 유관속 시들음 증상이 형질전환 되지 않은 식물체에서 병징의 scale은 3.2와 3.0으로 나타나는 반면 형질전환된 식물체에서는 2.0과 2.5으로 비교적 낮게 나타났다.

• Journal of Plant Biotechnology
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• 제32권3호
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• pp.161-165
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• 2005

Agrobacterium과 자엽절편의 공동배양으로 박과작물인 오이의 형질전환체를 생산하였다. 오이 배양재료는 "은침"의 자엽절편을 사용하였으며, reporter유전자로서 gus유전자와 선발표지로서 bar 또는 nptII유전자로 각각 제작된 pPTN289와 pPTN290벡터를 GV3101, LBA4404, EHA101에 형질전환하여 공동배양하였다. 형질전환빈도는 Agrobacterium의 종류에 따라 현저한 차이가 있었으며, 특히 사용한 균주중 EHA101에서 0.35%로 가장 높았다. 선발배지에서 형성된 오이 식물체중 제초제 저항성 (12개체)과 paromomycin 저항성 (3개체)을 얻었고, 이들 모두 gus양성반응 나타냈다. Southern분석에 의하여 오이 형질전환체의 genome에 gus유전자가 도입되어 있음을 확인 하였다.

• Journal of Plant Biotechnology
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• 제30권3호
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• pp.233-239
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• 2003

We have developed a reliable and high-frequency genetic transformation and regeneration system via somatic embryogensis of Eleutherococcus sessiliflorus. Embryogenic callus obtained from seed were co- cultivated with Agrobacterium tumefaciens strain EHA101/pIG121Hm harboring genes for intron-$\beta$-glucoronidase(GUS), kanamycin and hygromycin resistance. Following co-cultivation, two types of samples(fine embrogenic calli and early globular embryo clusters) were cultivated on Murashige and Skoog(MS) medium containing 1 mg/L2.4-D for 3day in dark. Transient expression of GUS gene was found to be higher in the early globular embryo clusters than in the embryogenic calli. Also, co-cultivated period affected expression of GUS gene; the best result was obtained when globular embryo clusters were co-cultivated with Agrobacterium for 3 days. Subsequently, this callus transferred to selective MS medium containing 1mg/L2.4-D, 50mg/L kanamycin or/and 30mg/L hygromycin and 300mg/L cefortaxime. These embryogenic calls were subcultured to the same selection medium at every 2 weeks intervals. Approximately 24.5% of the early globular embryos co-cultivated with Agrobacterium for 3days produced kanamycin or/and hygromycin-resistant calli. Transgenic somatic embryos were converted into plantlets in half strength MS medium supplemented with 3mg/L GA$_3$ kanamycin and were confirmed by GUS histochemical assay and polymerase chain reaction analysis. Genomic Southem blot hybridization confirmed the incorporation of NPT II gene into the host genome.

• 한국약용작물학회지
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• 제15권5호
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• pp.339-345
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• 2007

Field performance and morphological characterization was conducted on seven transgenic lines of Codonopsis lanceolata expressing ${\gamma}-TMT$ gene. The shoots were obtained from leaf explants after co-cultivation with Agrobacterium tume-faciens strain LBA 4404 harboring a binary vector pYBI 121 that carried genes encoding ${\gamma}-Tocopherol$ methyltransferase gene (${\gamma}-TMT$) and a neomycin phosphotransferase II gene (npt II) for kanamycin resistance. The transgenic plants were transferred to a green house for acclimation. Integration of T-DNA into the $T_0\;and\;T_1$ generation of transgenic Codonopsis lanceolata genome was confirmed by the polymerase chain reaction and southern blot analysis. The progenies of transgenic plants showed phenotypic differences within the different lines and with relative to control plants. When grown in field, the transgenic plants in general exhibited increased fertility, significant improvement in the shoot weight, root weight, shoot height and rachis length with relation to the control plants. However, all seven independently derived transgenic lines produced normal flower with respect to its shape, size, color and seeds number at its maturity. Indicating that the addition of a selectable marker gene in the plant genome does not effect on seed germination and agronomic performance of transgenic Codonopsis lanceolata. $T_1$ progenies of these plants were obtained and evaluated together with control plant in a field experiment. Overall, the agronomic performance of $T_1$ progenies of transgenic Codonopsis lanceolata showed superior to that of the seed derived non-transgenic plant. In this study, we report on the morphological variation and agronomic performance of transgenic Codonopsis lanceolata developed by Agrobacterium transformation.

• Journal of Plant Biotechnology
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• 제33권1호
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• pp.19-25
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• 2006

저온저항성 BN115 gene과 표지유전자로서 kanamycin에 저항성 있는 nptII gene을 가지고 있는 식물발현용 binary vector pBin19/BNl15가 도입된 A. tumefacience MP90을 국화잎과 공동배양 하였다. 또한 particle bombardment를 이용하여 목적으로 하는 유전자가 식물체에 안정적으로 도입되어 발현됨을 PCR 및 Real-Time PCR 검정으로 확인하였다. 국화잎과 공동배양에 사용된 Agrobacterium은 $5.0{\times}1.0{\mu}m$로 non-sporing, motile, rod 형이며, Callus는 pin이나 cork-borer에 의해 상처 난 잎 가장자리로부터 형성되어 식물체가 재분화 되었다. 유전자 도입조건은 Agrobacterium을$O.D._{600}{\approx}0.5$에서 20분간 공동배양 할 때, Particle bombardment는 helium 압력을 1,100 psi, target 거리를 9 cm로 유지했을 때, 가장 효율이 높았다. 5mg/L kanamycin이 들어 있는 배지에서 선발된 형질전환체는 PCR 분석으로 형질전환여부를 판별할 수 있었으며, 선발 10개체 중 9개체에서 purified pBN115와 같은 크기의 밴드가 형성되었다. Taq-Man probe를 이용한 Real-Time PCR 결과 $45{\sim}0.00045ng/{\mu}{\ell}$ 범위에서 pBN115 gene을 10배씩 serial dilution한 amplification plot는 일정한 간격으로 standard curve를 보였으며, slope는 -3.313975, R2는 0.998319이었다. Amplification plots의 형질전환체 $C_T$값은 $20.75{\sim}33.81$범위였으며, 유전자 copy수는 정량분석을 기초로 산출하였다. pBN115의 plasmid DNA를 serial dilution했을 때, standard는 $5.6{\times}10^{10}/45ng{\sim} 5.6{\times}10^5/0.00045ng\;copies/{\mu}{\ell}$이 었으며, 형질전환체는 $3.86{\times}10^8{\sim}12565.71 copies/{\mu}{\ell}$이었다. 따라서 PCR, Real-Time PCR 분석 결과 저온저항성 유전자가 국화의 genome에 안정적으로 도입되었음이 확인되었다.