• 한국식품과학회지
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• 제32권1호
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• pp.161-167
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• 2000

한국의 재래식메주로부터 분리 동정한 Aspergillus wentti가 생산하는 protease를 정제하고 그 특성을 조사하였다. 기본배지[밀기울 :1% glucose 함유$H_2O=1:1\;(w/v)]$에서의 효소생산 최적조건은 pH 9.0, $30^{\circ}C$, 4일 이었다. 효소의 정제는 먼저 배양 밀기울로부터 20mM phosphate(pH 8.0)로 효소를 추출하고 QAE-Sephadex와 SP-Sephadex의 ion exchange chromatography로 비흡착성 활성단백질을 분리한 후 두차례의 Sephadex G-100 gel filtration로서 분자량 약 32,000(SDS-PAGE분석 : 단일밴드)의 비활성도 213unit/mg, 정제배수 27.3배로 효소를 정제하였다. 본 효소의 $K_m$값은 $3.049{\times}10^{(-4)}M,\;V_(max)$값은 $151.1\;{\mu}g/min$이었으며 ISP, hemoglobin, bovine albumin 보다 casein에 대해 가수분해력이 높은 것으로 나타났다. 정제효소의 최적작용 pH와 온도는 pH 9.0, $50^{\circ}C$였으며 pH $4.0{\sim}11.0$의 범위와 $40^{\circ}C$이하에서 안정하였으며 효소활성은 금속이온에 의해 영향을 받지 않았고 2mM의 phenylmetanesulfonyl fluoride에 의해 86% 실활되었다. 이 결과로부터 본 효소는 효소 활성부위가 serine의 OH기인 serine protease인 것으로 밝혀졌다.

• 한국초지조사료학회지
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• 제24권1호
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• pp.25-28
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• 2004

오차드그라스(Dactylis glomerata L.)의 치사온도를 결정하기 위하여, 국내 육성품종인 "장벌 102호"(Jangbeol 102) 품종을 시험재료로 하여 종자를 petri dish에서 발아시켜 작은 화분에 10 개체씩 이식, 생장실에서 4주간 재배하였다. $45^{\circ}C$, $50^{\circ}C$ 및 $55^{\circ}C$에서 처리한 경우에는 60분간 처리했을 때에도 거의 식물체 손상이 없었다. $60^{\circ}C$에서 30분간 이상 처리했을 때에는 잎 끝이 마르고 약간 시들었으나 식물체의 손상은 약한 편이었으며, $65^{\circ}C$에서 처리한 결과에서도 $60^{\circ}C$에서 처리했을 때보다는 좀 더 시들었지만 역시 심한 정도는 아니었다. $70^{\circ}C$에서 30분간 처리했을 때에 오차드그라스는 잎의 중간 정도까지 말랐으며, 60분간 처리했을 때에는 지상부의 잎이 2/3 이상 마른 상태였다. $80^{\circ}C$에서 처리한 결과에서는 처리 후 1일 이내에 50분 이상 처리에서 거의 죽어가는 현상이 나타났다. 처리 후 7일에는 55분 이상의 처리에서만 모두 죽었으며, 50분 이하의 처리에서는 새로운 shoot가 재생됨을 확인하였다. 결론적으로 오차드그라스의 치사온도는 $80^{\circ}C$에서 55분 처리하는 것으로 결정되었다.

• 생명과학회지
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• 제13권6호
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• pp.805-813
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• 2003

돌돔 (Oplegnathus fasciatus) SL을 암호화하는 cDNA clone을 뇌하수체로부터 RT-PCR 방법에 의해 획득하였다. 돌돔 SL cDNA의 길이는 1636 bp로서 24개의 아미노산인 signal peptide와 207개 의 aa으로 구성된 mature protein을 암호화하는 696 bp의 open reading frame을 갖고 있다. 또한, 돌돔 SL 아미노산에는 이황화 결합에 관여하는 7개의 시스테인 잔기 $(Cys^{5},\; Cys^{15},\; Cys^{42},\; Cys^{65},\; Cys^{181},\; Cys^{198}\$ 과 $Cys^{206})$와 두 개의 potential N-glycosylation site인 $Asn^{121}$ 과 $Asn^{153}$을 확인하였다. 돌돔 SL은 goldfish와 channel catfish를 제외한 다른 경골어류 SL에 아미노산 서열은 61.1∼92.6%, 뉴클레오타이드 서열은 63∼92.6%의 일치를 나타낸다. 아미노산 서열 alingment에서 돌돔 SL은 다른 어류 SL에 공통적인 4개의 conserved domain $(A_{SL},\; B_{SL},\; C_{SL}$과 $D_{SL})$을 갖고 있음을 확인하였다. 이들중 $A_{SL},\; B_{SL}$,과 $D_{SL}$,은 경골어류 growth hormone과 prolactin에도 잘 보존되어 있었다 재조합 돌돔 SL 단백질을 E. coli에서 생산하기 위해 돌돔 SL cDNA를 발현벡터에 클로닝하여 단백질의 발현을 유도하였다 발현된 단백질은 SDS-PAGE에 의해 분자량 약 27 kDa의 재조합 단백질의 발현을 확인하였다.

• 생명과학회지
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• 제17권10호
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• pp.1341-1346
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• 2007

Paenibacillus sp. DG-22로부터 세포내 효소인 ${\beta}-xylosidase$가 이온교환, 소수성 상호작용, 겔여과 크래마토그래피에 의해 순수하게 정제되었다. 이 효소의 분자량은 겔여과에 의해서는 156,000으로, SDS-PACE에 의해서는 80,000으로 측정되었는데 이것은 이 효소가 동일한 두 소단위로 구성되어 있음을 나타낸다. 정제된 효소는 $65^{\circ}C$와 pH 5.5에서 최대 활성을 나타내었다. 이 효소는 $60^{\circ}C$에서 60분까지 초기 활성의 80%를 유지하였고 $65^{\circ}C$에서 25분의 반감기를 가지고 있었다. 이 효소는 기질로서 pNPX에 매우 특이적이었고 다른 p-nitrophenyl 글리코시드들과 자일란에는 활성을 나타내지 않았다. pNPX에 대한 $K_m$과 $V_{max}$는 각각 0.53 mM과 3.18 U/mg단백질이었다. 이 ${\beta}-xylosidase$는 $Ag^+,\;Fe^{2+},\;Hg^{2+}$ 및 $Zn^{2+}$에 의해 강하게 억제되었으며 DTT에 의해서 약간 활성화되었다. 자일로바이오스, 자일로트라이오스 및 자일로데트라오스로부터의 가수분해 산물은 자일로오스이었다.

• 생명과학회지
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• 제20권5호
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• pp.683-690
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• 2010

효모 Saccharomyces diastaticus 는 세포 외로 분비되는 glucoamylase I, II, III 동위효소 중 하나를 생산하여 전분을 가수분해하여 포도당을 생성할 수 있다. Glucoamylase I, II, III는 STA1, STA2, STA3 유전자에 의해 각각 암호화된다. 효모 Saccharomyces 속이 포자가 형성되는 시기에 세포 내에서 특이적으로 발현된다고 알려진 glucoamylase (SGA)의 분자생물학적 및 생화학적 연구를 수행하기 위한 일환으로 S. diastaticus YIY 345 형질전환체의 배양 상등액으로부터 SGA 정제를 시도하였다. 황산암모늄 침전, DEAE-Sephadex A-50, CM-Sephadex C-50, Sephadex G-200 chromatography 등의 정제과정을 거쳐서 비특이 활성이 174배 증가된 0.22 mg의 순수한 SGA를 얻었다. HPLC와 SDS-PAGE 분석을 통해 이 효소는 63, 68 kDa의 단위체로 구성된 이합체임을 확인할 수 있었다. Con-A Sepharose 친화성 크로마토그피와 탈당쇄 효소를 처리한 결과로부터 SGA는 N-연결형 당쇄로 수식되었으며 단백질 부분은 59 kDa이었다. 정제한 SGA와 세포 외 분비성 glucoamylase의 효소학적 특성을 조사하고 비교한 결과 SGA의 최적 pH와 온도는 각각 5.5와 $45^{\circ}C$로 나타났으며 세포 외 분비성 glucoamylase는 5.0과 $50^{\circ}C$로 나타났다. SGA는 세포 외로 분비되는 glucoamylase에 비해 열처리 및 SDS에 대해 더 민감한 반응성을 나타내었다.

• 생명과학회지
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• 제23권12호
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• pp.1486-1494
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• 2013

Octopus vulgaris의 장관으로부터 단백질 가수분해력과 활성을 측정함으로서 높은 단백질분해효소 생성능을 가진 균을 분리하여 동정하였다. 균이 생성한 단백질분해효소는 황산암모늄침전, cellulose CM-52 양이온 교환 크로마토그래피, DEAE-Sephadex A50 음이온 교환 크로마토그래피의 3단계를 통해 정제하였다. 장관으로부터 분리한 균중 가장 높은 단백질분해효소 생성능을 가진 균은 Bacillus sp. QDV-3로 나타났으며 이균을 분리한 후 표현형 분석, 생화학적 특성, 16S rRNA 유전자염기서열분석을 통해 Bacteria역, Firmicutes문, Bacilli강, Bacillales목, Bacillaceae과, Bacillus속으로 Bacillus flexus와 99.2%의 유사성을 보이는 것으로 확인하였다. 균이 생성한 단백질 분해효소를 QDV-E로 지정하였으며 61.6 kDa의 분자량을 나타내었다. 이 효소는 pH 9.0~9.5에서 활성을 나타내었고 최적온도는 $40^{\circ}C$였으며 $50^{\circ}C$에서는 60분간 96% 이상의 활성을 보유하였다. Phenyl methyl sulfonyl fluoride (PMSF)에 의하여 활성이 억제 되었으므로 세린 알칼리성 단백 분해 효소인 것으로 결론지었다. 금속이온인 $Mn^{2+}$ 와 $Mg^{2+}$에 의하여 효소활성 상승효과를 보였으며 $Ba^{2+}$, $Zn^{2+}$, 그리고 $Cu^{2+}$에 의하여 활성이 억제되었다.

• 미생물학회지
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• 제42권3호
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• pp.199-204
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• 2006

제주지역 양식넙치의 주요 세균성 질병의 일종인 연쇄구균증 발병동향과 특성을 분석하였다. 제주지역 양식넙치의 연쇄구균증은 연중 발생하는 양상을 보였으나 상대적으로 고수온기에 발생율이 높았으며, 30cm 이상의 개체에서 주로 관찰되었다. 2003년 6월부터 2005년 5월 사이에 분리된 연쇄구균 균주를 multiplex PCR assay 기법을 이용하여 종 조성을 분리한 결과 Streptococcus iniae와 S. parauberis로 동정되었으며 그 비율은 각각 46%와 54%이었다. S. iniae는 상대적으로 9월과 10월에 높은 분리율을 나타내었으나 S. parauberissms 3월과 4월에 분리율이 높게 나타났다. S. iniae와 S. parauberis 감염개체의 병리학적 중상은 일부분 유사하였으나 S. iniae 분리개체는 복부팽만, 탈장, 복수저류증상이 주로 관찰되는 반면, S. parauberis 분리개체는 체색흑화, 무안측 발적 중상이 두드러지게 관찰되었다. 이 두 종의 병원체 모두 ampicillin과 amoxicillin에 감수성이 높았으며, S. iniae 균주들은 S. parauberis 균주들보다 상대적으로 doxycycline, erythromycin, oxytetracycline에 감수성이 높았다.

• KSBB Journal
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• 제16권2호
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• pp.188-199
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• 2001

10%의 $\alpha-(1\rightarrow3)$가지 결합을 갖고 $\alpha-(1\rightarrow6)$으로 연결된 댁스트란을 합성하는 텍스트란수크라제를 coding하는 유전자 (dsCB)를 Leuconostoc mesenteroides B-742CB로부터 분리하여 염기서열과 아미노산 서열을 결정하였다. dsCB가 포항된 6 6.lkb띄 DNA fragment는 4,536 bp의 염기로 구성된 하나의 open reading 잔ame(ORF)를 가지고 있었다. 추정된 아미노산 서열은 ORF의 698벤째 nucleotide 위치에 있는 start codon (ATG)으로부터 5,223번째 위치에 있는 slop codon(TAA)까지 였다. 구조 유전자의 아마노산은 1,5087H로 구성되고 분자량의 계산값은 168.6 kDa었고 non-denatured SDS-PAGE를 이용하여 활성 band툴 분석한 결과 170 kDa이었다. pDSCB를 까지고 있는 재조합 E. coli는 2 % sucrose배치에서 세포외로 댁스트란수크라제를 생산하였으며, soluble과 insoluble 텍스트 란을 생산하였다. 텍스트란수크라체의 효소 촉매작용에 관여 하는 것으로 얄려져있는 conserved region의 아미노산 중 Asp-492를 Asparagine으로 바꾸고자 point mutation을 시도하였고, 결과로 얻어친 D492N은 돌연변이 이전의 균에 비하여 활성이 1.6배 감소함을 확인하였다.

• Journal of Microbiology and Biotechnology
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• 제14권3호
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• pp.584-592
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• 2004

A thermostable $\beta$-glycosidase gene, tfi $\beta$-gly, was cloned from the genomic library of Thermus filiformis Wai33 A1. ifi $\beta$-gly consists of 1,296 bp nucleotide sequence and encodes a polypeptide of 431 amino acids. It shares a strong amino acid sequence similarity with the $\beta$-glycosidases from other Thermus spp. belonging to the glycosyl hydrolase family 1. In the present study, the enzyme was overexpressed in Escherichia coli BL21 (DE3) using the pET21b(+) vector system. The recombinant enzyme was purified to homogeneity by heat treatment and a $Ni^{2+}$-affinity chromatography. Polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) showed that the recombinant Tfi $\beta$-glycosidase was a monomeric form with molecular mass of 49 kDa. The temperature and pH range for optimal activity of the purified enzyme were 80- $90^{\circ}C$ and 5.0-6.0, respectively. Ninety-three percent of the enzyme activity was remained at $70^{\circ}C$ after 12 h, and its half-life at $80^{\circ}C$ was 6 h, indicating that Tfi $\beta$-glycosidase is highly thermostable. Based on its K_m$, or $K_{cat}K_m$, ratio, Tfi $\beta$-glycosidase appeared to have higher affinity for $\beta$-D-glucoside than for $\beta$-D-galactoside, however, $K_{cat} for \beta$-D-galactoside was much higher than that for $\beta$-D-glucoside. The activity for lactose hydrolysis was proportionally increased at $70^{\circ}C$ and pH 7.0 without substrate inhibition until reaching 250 mM lactose concentration. The specific activity of Tfi TEX>$\beta$-glycosidase on 138 mM lactose at $70{^\circ}C$ and pH 7.0 was 134.9 U/mg. Consequently, this newly cloned enzyme appears to have a valuable advantage of conducting biotechnological processes at elevated temperature during milk pasteurization in the production of low-lactose milk.

• 한국미생물·생명공학회지
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• 제30권1호
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• pp.1-7
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• 2002

토양으로부터 phytate 분해능이 뛰어난 phytate를 생산하는 균주를 분리 동정한 결과 Escherichia coli로 동정되었고, E. coli WC7으로 명명하였다. 이 균주가 생산하는 phytase를 ammonium sulfate 침전, Phenyl-Sepharose, DEAE-Sepharose, CM-Sepharose, Resoure S, Mono S 컬럼 크로마토그래피를 이용한 분리정제를 수행하여 정제도 1,250 배, 수율 30%로 정제하였고 640 Unit/mg의 비활성을 얻었다. 또한 정제된 phytase는 SDS-PAGE에서 분자량 45kDa인 단일 subunit로 이루어진 단일효소임을 확인하였다. E. coli WC7 phytase의 최적 pH는 5.0, 최적 온도는 $60^{\circ}C$였으며, pH 2.0-12까지 안정하였다. 열안정성에서는 $60^{\circ}C$이상에서 급격한 활성의 감소를 보여 초기 활성의 20% 활성만을 나타내었다. Phytase의 N-말단 아미노산 서열은 Ser-Glu-Pro-Clu-Leu-Lys-Leu-Glu-Ser-Val-Val이었으며 이는 E. coli 유래의 pH 2.5 acid phosphatase와 아주 큰 유사성을 보였다. S. coli WC7 phytase의 유전자를 확보하기 위해 E. coli acid phosphatase의 DNA sequence를 바탕으로 한 primer들을 이용하여 PCR 클로닝을 수행하였으며 증폭된 PCR fragment를 pUC19 벡터에 클로닝 하고 DNA 염기서열을 결정하였다. 그 결과 1.2 kbp의 WC7 phytase 유전자의 ORF를 확인하였으며 432개의 아미노산으로 이루어진 분자량 44,716 Da의 단백질을 확인 할 수 있었다. 대부분의 acid phosphatase 효소들의 active site라고 추정되는 active site motif인 RHGXRXP가 N-terminal 쪽에 존재하고 있었다. pUEP를 이용하여 E. coli XL1-Blue에서 phytase를 발현시켰을 때 효소의 생산량이 17.5 U/ml로서 원균주의 23배 활성을 가졌으며,효소의 비활성 및 pH 안정성 측면에서 높은 산업적 이용가능성을 볼 때 사료첨가제 효소로의 개발을 기대할 수 있을 것이라 판단된다.