각거 시요로부터 분이된 215주의 Rhizopus 속중 lipase생성자이 강한 1 주를 선정하여 균학적 성질 및 lipase생성 조건을 검토한 결과는 다음과 같다. (1) 우수균주 strain K52는 균학적 제성질을 살펴본 결과 Rhizopus delemar에 유사하였다. (2) 배양기간은 밀기울 고예배양의 경우 48시간, 액면배양의 경우는 96시간, 진악배양의 경우는 72시간 경과후 최고의 역가를 나타 내었다. (3) 진종배양시보다 액면배양시에 lipase의 생성이 더욱 양호하였다. (4) 밀기울 고예배양시에도 효소의 생성이 양호하였으며 배양 48시간후 3.800(u/g)의 활성을 나타내었다. (5) 배양최적온도는 액체배양시나 국체배양시 모두 3$0^{\circ}C$가 가장 양호하였다.
활성 효모의 동물사료 첨가제로의 이용성을 증진시키기 위하여 lipase 생산성이 높은 효모를 (주)강남유지로부터 채취한 폐유와 슬러지로부터 분리하였다. 분리된 균주를 이용, 자외선 돌연변이를 통해 lipase 생산성이 높은 균주를 개발하였으며 산업용 배양배지의 선별, 배양공정의 개선에 관한 연구를 수행하였다. 산업용 배지의 탄소원으로는 고과당, 질소원으로는 CSL이 각각 선정되었으며, 2%의 고과당, 1%의 CSL에서 배양조건을 최적화시키고자 하였다. 1%의 올리브유 첨가, 접종량 4%, 초기 pH 5, 그리고 배양온도 27$^{\circ}C$에서 lipase의 생산성이 최대가 됨을 확인할 수 있었으며 이 때 lipase 역가는 1.12 U/mL를 얻을 수 있었다.
유지방구로부터 분리 정제한 lipase의 활성과 안정성에 미치는 pH의 영향을 야자유와 균질유를 기질로 하여 조사하였다. 효소원으로 buttermilk를 사용하였을 경우는 반응온도 $37^{\circ}C$에서 야자유, 균질유 모두 pH 9.5에서 최대 활성을 나타내었으며, 전형적인 종형의 pH의 존곡선을 나타내었다. 그러나 반응온도 $0^{\circ}C$에서는 pH 10.0까지 활성이 증가하였다. 정제 lipase를 사용한 경우는 반응응도 $37^{\circ}C$에서 균질유를 기질로 사용하였을 때 종 모양의 곡선을 나타내었으며, 최대 활성은 pH 9.0에서 나타났다. 반응온도 $0^{\circ}C$에서는 pH 10.0까지 활성이 계속 증가하였다. BSA를 첨가한 야자유를 기질로 사용한 경우는 반응온도 $37^{\circ}C$, $0^{\circ}C$ 모두 최대 활성이 pH 9.5에 나타났으며, pH 10.0에서는 활성이 현저하게 저하하였다. 정제 lipase의 안정성에 미치는 pH의 증가에 따라 현저하게 저하하였다. pH 10.0에서 $37^{\circ}C$로 20분간 효소를 유지하였을 경우 lipase의 활성은 pH 8.5 때의 활성에 비하여 13%로 감소하였다. 그러나, $4^{\circ}C$에서 60분간 효소를 유지하였을 경우는 lipase 활성이 pH 7.5∼10.0의 범위에서 안정하였다.
Lipases are industrially useful versatile enzymes that catalyze numerous different reactions. Among lipases functioning under extreme conditions, alkaline lipase is useful in detergent industry. Lipase from yeast strain Yarrowia lipolytica NRRL Y-2178 was most active under alkaline condition, and initial medium pH for most lipase production was also alkaline [Lee et al., 2007, J Microbiol Biotechnol, 17(6)]. High lipase production was achieved using Y. lipolytica NRRL Y-2178. Optimal incubation time for lipase production at $25^{\circ}C$ was 72 h. Optimal temperature, when incubated for 72 h, was $27.5^{\circ}C$. Lipase production but not cell growth was very sensitive to concentrations of glucose and glycerol as efficient carbon sources, showing optimal concentrations of 1.0 and 1.5% (w/v), respectively. Lipase production was highly stimulated by $Ca^{2+},\;K^+,\;and\;Na^+$, but was inhibited by $Co^{2+},\;Cu^{2+},\;Mn^{2+},\;Na^+,\;and\;Fe^{2+}$. Maximum lipase production at 0.1 mM $Ca^{2+}$ for 72 h incubation at $27.5^{\circ}C$ was 649 units/mL.
Park, In-Hye;Kim, Sun-Hee;Lee, Yong-Seok;Lee, Sang-Cheol;Zhou, Yi;Kim, Cheol-Min;Ahn, Soon-Cheol;Choi, Yong-Lark
Journal of Microbiology and Biotechnology
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제19권2호
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pp.128-135
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2009
Acinetohacter baumannii BD5 was isolated from waters of Baek-du mountain, and the lipase gene was cloned using a PCR technique. The deduced amino acid sequence of the lipase and lipase chaperone were found to encode proteins of 325 aa and 344 aa with a molecular mass of 35 kDa and 37 kDa, respectively. The lipase gene was cloned and expressed in Escherichia coli BL21(trxB) as an inclusion body, which was subsequently solubilized by urea, and then purified using Ni-affinity chromatography. After being purified, the lipase was refolded by incubation at $4^{\circ}C$ in the presence of a 1:10 molar ratio of lipase:chaperone. The maximal activity of the refolded lipase was observed at a temperature of $35^{\circ}C$ and pH 8.3 when p-NP caprate(C10) was used as a substrate; however, 28% of the activity observed at $35^{\circ}C$ was still remaining at $0^{\circ}C$. The stability of the purified enzyme at low temperatures indicates that it is a cold-adapted enzyme. The refolded lipase was activated by $Ca^{2+},\;Mg^{2+},\;and\;Mn^{2+}$, whereas $Zn^{2+}\;and\;Cu^{2+}$ inhibited it. Additionally, 0.1% Tween 20 increased the lipase activity by 33%, but SDS and Triton X-100 inhibited the lipase activity by 40% and 70%, respectively.
Zhang, Yuhong;Shi, Pengjun;Liu, Wanli;Meng, Kun;Bai, Yingguo;Wang, Guozeng;Zhan, Zhichun;Yao, Bin
Journal of Microbiology and Biotechnology
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제19권9호
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pp.888-897
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2009
Lipase diversity in glacier soil was assessed by culture-independent metagenomic DNA fragment screening and confirmed by cell culture experiments. A set of degenerate PCR primers specific for lipases of the hormone-sensitive lipase family was designed based on conserved motifs and used to directly PCR amplify metagenomic DNA from glacier soil. These products were used to construct a lipase fragment clone library. Among the 300 clones sequenced for the analysis, 201 clones encoding partiallipases shared 51-82% identity to known lipases in GenBank. Based on a phylogenetic analysis, five divergent clusters were established, one of which may represent a previously unidentified lipase subfamily. In the culture study, 11 lipase-producing bacteria were selectively isolated and characterized by 16S rDNA sequences. Using the above-mentioned degenerate primers, seven lipase gene fragments were cloned, but not all of them could be accounted for by the clones in the library. Two full-length lipase genes obtained by TAIL-PCR were expressed in Pichia pastoris and characterized. Both were authentic lipases with optimum temperatures of ${\le}40^{\circ}C$. Our study indicates the abundant lipase diversity in glacier soil as well as the feasibility of sequence-based screening in discovering new lipase genes from complex environmental samples.
Lipases are industrially useful versatile enzymes that catalyze numerous different reactions including hydrolysis of triglycerides, transesterification, and chiral synthesis of esters under natural conditions. Although lipases from various sources have been widely used in industrial applications, such as in food, chemical, pharmaceutical, and detergent industries, there are still substantial current interests in developing new microbial lipases, specifically those functioning in abnormal conditions. We screened 17 lipase-producing yeast strains, which were prescreened for substrate specificity of lipase from more than 500 yeast strains from the Agricultural Research Service Culture Collection (Peoria, IL, U.S.A.), and selected Yarrowia lipolytica NRRL Y-2178 as a best lipase producer. This report presents new finding and optimal production of a novel extracellular alkaline lipase from Y. lipolytica NRRL Y-2178. Optimal culture conditions for lipase production by Y. lipolytica NRRL Y-2178 were 72 h incubation time, $27.5^{\circ}C$, pH 9.0. Glycerol and glucose were efficiently used as the most efficient carbon sources, and a combination of yeast extract and peptone was a good nitrogen source for lipase production by Y. lipolytica NRRL Y-2178. These results suggested that Y. lipolytica NRRL Y-2178 shows good industrial potential as a new alkaline lipase producer.
경기도 일대에서 수집한 메주 시료에서 지질분해 활성을 나타내는 균주 Y124를 분리하여 동정한 결과 Yarrowia lipolytica와 100% 상동성을 보였다. 분리 균주가 생산하는 lipase의 조효소에 대한 일반적인 특성을 조사한 결과, 탄소원으로 olive oil을 단독으로 사용한 YPO 배지에서 8시간 배양하였을 때 lipase 활성이 가장 높게 나타났다. YPD 배지에서는 lipase 활성이 거의 없었으며, olive oil과 glucose를 모두 포함하는 YPDO 배지에서는 lipase 활성이 YPO 배지 보다 낮았다. 그리고 olive oil 농도에 따른 lipase 활성을 측정한 결과, olive oil 무첨가보다 0.7% 첨가하여 8시간 배양했을 때 lipase 활성이134 U/mL으로 가장 높게 나타나 lipase의 생산이 olive oil의 첨가에 의해 유도되는 것으로 생각된다. 생육온도에 따른 lipase 활성 측정한 결과, $30^{\circ}C$에 배양하였을 때 배양 8시간에 가장 높은 활성이 나타났고, $25^{\circ}C$와 $37^{\circ}C$에 배양하였을 때는 배양 12시간에 활성이 가장 높게 나타났으며, Y124균주의 lipase 활성 최적 온도는 $30^{\circ}C$로 나타났다. 그리고 lipase의 기질 친화도를 확인한 결과 Y124균주가 생산하는 lipase의 경우 p-nitrophenyl octanoate ($C_8$)에서 가장 높은 활성이 나타났다.
In order to design industrial scale reactors and proceises for multi-phase biocatalytic reactions, it is essential to understand the mechanisms by which such systems operate. To il-lustrate how such mechanisms can be modeled, the hydrolysis of the primary ester groups of triglycerides to produce fatty acids and monoglycerides by lipased (glycerol-ester hydrolase) catalysis has been selected as an example of multiphase biocatalysis. Lipase is specific in its behavior such that it can act only on the hydrolyzed (or emulsified) part of the substrate. This follows because the active center of the enzyme is catalytically active only when the substrate contacts it in its hydrolyzed form. In other words, lipase acts only when it can shuttleback and forth between the emulsion phase and the water phase, presumably within an interphase or boundary layer between these two phases. In industrial applications lipase is employed as a fat splitting enzyme to remove fat stains from fabrics, in making cheese, to flavor milk products, and to degrade fats in waste products. Effective use of lipase in these processes requires a fundamental understanding of its kinetic behavior and interactions with substrates under various environmental conditions. Therefore, this study focuses on modeling and simulating the enzymatic activity of the lipase as a step towards the basic understanding of multi-phase biocatalysis processes.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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