The aim of this study was to evaluate the functional properties of lactic acid bacteria from various sources and to identify strains for use as probiotics. Ten Lactobacillus strains were selected and their properties such as bile tolerance, acid resistance, cholesterol assimilation activity, and adherence to HT-29 cells were assessed to determine their potential as probiotics. Lactobacillus sp. JNU 8829, L. casei MB3, L. sakei MA9, L. sakei CH8, and L. acidophilus M23 were found to show full tolerance to the 0.3% bile acid. All strains without L. acidophilus M23 were the most acid-tolerant strains. After incubating the strains at pH 2.5 for 2 h, their viability decreased by 3 Log cells. Some strains survived at pH 2.5 in the presence of pepsin and 0.3% bile acid. Lactobacillus sp. JNU 8829, L. acidophilus KU41, L. acidophilus M23, L. fermentum NS2, L. plantarum M13, and L. plantarum NS3 were found to reduce cholesterol levels by >50% in vitro. In the adhesion assay, Lactobacillus sp. JNU 8829, L. casei MB3, L. sakei MA9, and L. sakei CH8 showed higher adhesion activities after 2 h of co-incubation with the intestinal cells. The results of this comprehensive analysis shows that this new probiotic strain named, Lactobacillus sp. JNU 8829 could be a promising candidate for dairy products.
건강한 닭의 맹장에서 분리한 Lactobacillus sakei LAB 2와 LAB 8의 생균제로 이용을 알아보기 위해 기본적인 특성과 면역활성을 시험하였다. LAB 2와 LAB 8은 높은 내산성과 내담즙성을 가지고 있으며, 1차 대사산물인 유기산에 기인한 항균활성을 보였다. Salmonella 종을 병원성균으로 이용하여 최대 항균력을 나타내는 시간을 시험한 결과 48시간으로 나타났으며, 생성된 유기산 중 젖산의 생산량은 다른 Lactobacillus 균주보다 높게 조사되었다. In vitro 모델로 알아본 면역증진효과는 면역관련 세포의 증식과 사이토카인의 생산량 증가로 확인하였다. 이에 Lactobacillus sakei LAB 2와 LAB 8은 유용한 생균제로 개발할 수 있는 균으로 생각된다.
배추김치로부터 식품유해균인 Listeria monocytogenes를 저해하는 박테리오신을 생산하는 유산균, Lactobacillus sakei P3-1이 분리되었다. 형태학적, 생화학적 특성조사와 최종적으로 PCR로 증폭하여 얻은 16S rDNA 염기서열 결정을 통해서 L. sakei로 동정되었다. L. sakei P3-1이 분비하는 박테리오신은 여러 그람 양성 및 음성균들 중에서 단지 L. monocytogenes만을 저해하는 그래서 저해범위가 매우 좁은 박테리오신으로 확인되었다. 이온교환 크로마토그래피에 의해서 박테리오신은 부분 정제되었으며 박테리오신의 열처리 안정성을 조사한 결과 121$^{\circ}C$에서 15분간 그리고10$0^{\circ}C$에서 10분간 열처리 후에도 각각 12.5%와 50%의 역가가 잔존하여 상당한 열안정성을 지니고 있음을 알 수 있었다. MRS배지에서 배양중 배양온도가 박테리오신 역가에 미치는 영향을 조사한 결과 3$0^{\circ}C$에서 배양할 때 그리고 18시간 이상 배양에서 가장 높은 1,000 AU/mL 역가를 보였다. 한편 SDS-PAGE 및 activity staining에 의해 측정된 박테리오신의 분자량은 4,000이었다. L. monocytogenes 생육 억제능, 작은 분자량 및 높은 열안정성 등의 성질들을 종합적으로 고려할 때 L. sakei P3-1이 생산하는 박테리오신은 박테리오신들 중에서 class II-a에 속하는 것으로 추정된다.
건강한 성인의 분변으로부터 담즙산 분해능이 우수한 젖산균의 분리를 위하여 무작위 선별법과 도말법을 사용하여 층 120주의 젖산균을 1차 분리하였고, 그중 5종의 젖산균을 최종 선발하였다. 유용한 젖산균이 갖추어야할 중요한 성질인 내산성, 내담즙산성, 대장균 저해능을 시험한 결과 Lactobacillus sp. CK 102이 가장 우수한 균주로 나타났다. Lactobacillus sp. CK 102 균주는 pH 2.0에서 68% 이상의 내성과 1.0% 담즙산이 함유된 배지에서 90%이상의 내성을 나타냈으며 MRS 배지에서 대장균과 혼합 배양시 18시간 이내에 대장균을 100% 사멸시켰다. 젖산균제로써 기능이 가장 우수한 균주인 Lactobacillus sp. CK 102를 API kit와 16S rRNA sequencing 방법을 사용하여 동정한 결과 Lactobacillus platarum 으로 밝혀졌다. 이상의 결과에서 분리한 Lactobacillus sp. CK 102는 생균제로서 안전하게 이용할 수 있는 것으로 나타났다.
김치로부터 분리된 젖산균들의 16S rDNA 부분 염기서열 결정 결과, 6균주 중 2균주는 Leuconostoc mesenteroides로, 나머지 균주는 Lactobacillus속으로 재동정되었다. 이들 김치유래 젖산균들은 유제품 유래 젖산균과 마찬가지로 cell-envelope proteinase (CEP)로 추정되는 세포외 proteinase 활성을 보유하고 있는 것으로 나타났고, 젖산균의 CEP 특이적 primer를 제작하여 PCR을 수행한 결과, Leu. mesenteroides로부터는 예상 크기의 PCR 산물이 증폭되지 않았지만 Lactobacillus속 균주들로부터는 예상되는 1.2 kb 의 DNA 단편이 증폭되었다. Lactobacillus pentosus KFR1821의 genomic DNA로부터 증폭된 PCR 산물의 추정 아미노산서열은 Lactococcus lactis subsp. cremoris의 PrtP와 95%, Labtobacillus paracasei subsp. paracasei이 PrtP와 92%의 높은 상동성을 보였다. 증폭된 PCR 산물을 probe로 하여 Southern hybridization을 수행한 결과, Lb. pentosus KFR1821의 CEP 유전자는 chromosomal DNA에 암호화 되어있는 것으로 확인되었다.
Lactobacillus sake는 냉장온도(2-4 ℃)이하에서도 성장이 가능한 통성혐기성균으로서, sausage와 진공포장육의 제조에 관여하며, 동양에서는 청주의 발효와 김치의 숙성에도 큰 비중을 차지하는 것으로 알려지고 있다. 그러나 L. sake는 이들 식품의 제조시 과도한 발효의 진행으로 식품을 변질시켜 가치를 저하시키기도 한다. 본 연구에서는 L. sake의 생육을 효과적으로 저지하는 박테리오신을 생산하는 미생물을 김치로부터 분리하여 Lactobacillus sp. Oh-B3로 명명하였다. 최대의 박테리오신을 생산하기 위한 분리균의 배양조건은 초기 pH를 8.0으로 조절한 MRS배지에 접종하여 25℃에서 24시간동안 배양했을 때 최대의 박테리오신을 생산하였다. 분리균의 배양액을 원심분리하여 균체를 제거한 상등액에 ammonium sulfate를 첨가한 뒤, 얻어진 침전물을 투석하고 여과한 뒤, -20℃에 보관하며 조박테리오신 용액으로 사용하였다. 분리균이 생산하는 박테리오신은 pH 2.0-9.0의 넓은 범위에서 비교적 안정한 활성을 나타내었으며, 그람음성균에 대해서는 항균활성을 보이지 않았고 일부 그람양성균에 대해서만 활성을 나타내었다. 조박테리오신 용액에 각각의 단백질 분해효소를 처리한 후 박테리오신의 잔존활성을 측정한 결과 분리균이 생산하는 박테리오신은 대부분의 단백질분해효소에 의해 활성이 제거되었다. 그리고 조박테리오신 용액을 열처리를 한 뒤 잔존활성을 측정한 결과 분리균이 생산하는 박테리오신은 100℃에서도 매우 안정하였으며, autoclave를 하여도 50% 이상의 활성이 유지되었다. 일반적인 박테리오신과 마찬가지로 분리균이 생산하는 박테리오신은 bacteriocidal action을 하는 것으로 관찰되었다.
1. L. acidophilus 균주에 작용하는 bacteriocin을 생산하는 Lactobacillus속 균 7주를 발견하였다. bacteriocin 생산균주는 1주가 L. gasseri였고, 그 외에는 모두 L. acidophilus였다. 2. 조사한 bacteriocin생산 6균주 중 5균주는 대수발육 중기 혹은 후기 내지 정상기의 초기에 최대의 bacteriocin 활성을 나타내었으나, 그 후 급격히 활성이 감소하였다. 3. 이들의 bacteriocin은 단백분해효소 처리로 용이하게 실활하는 단백질성임을 나타내었으나, 핵산분해 효소에는 저항성이었다. 또 이들의 bacteriocin은 지금 까지 보고되고 있는 Lactobacillus속의 bacteriocin과 다르며, 정도의 차는 있으나 전부 10$0^{\circ}C$ 가열에 감수성이 있었다. 4. L. acidophilus ATCC 9857 및 L. acidophilus ATCC 4357이 생산하는 bacteriocin은 diethylether 처리에 활성이 감소하므로 지질을 함유함을 시사하였다. 5. L. acidophilus A4가 생산하는 bacteriocin은 지시균의 세포벽 외층의 규칙적 배열구조에 흡착함을 시사하였다. 또 L. acidophilus ATCC 4355가 생산하는 bacteriocin은 지시균의 세포벽에는 흡착하지 않음을 알 수 있었다.
Lactobacillus helveticus ATCC 55163을 MRS 및 6%, 12% 유청 배지와 각각에 효모 추출물을 1% 첨가한 유청 배지에서 배양하여 흡광도, pH, 총 산도 값을 측정하므로서 생육특성을 분석하였다. MRS 및 유청 배지에서의 대수기는 $3{\sim}21$시간으로 나타났고, 유청 배지에서의 pH는 $3{\sim}24$시간에 급격한 감소현상을, 총 산도 값은 이 시간대에 급격히 증가하는 반비례 현상을 보였다. 같은 시간대에 12% 유청 배지에 효모추출물을 1% 첨가하였을 때 다른 시험구보다 높은 생균수, 낮은 pH 값과 높은 총 산도 값을 보여 유청 농도와 효모 추출물이 균의 증식에 영향을 주었다.
전통발효식품으로부터 L. monocytogenes ATCC 19114에 강한 항균활성을 보이는 균주를 분리하였다. 분리된 균주의 형태학적 및 생화학적 특성과 16S rRNA 염기서열 분석을 통해 Lactobacillus salivarius LCH1227으로 동정되었다. L. salivarius LCH1227이 분비하는 항균물질은 L. monocytogenes 뿐만 아니라 vancomycin-resistant Enterococcus faecalis, Streptococcus agalactiae, Bacillus cereus, Lactobacillus fermentum 등과 같은 그람양성 세균에 대해 폭 넓은 항균 활성을 나타내었다. L. salivarius LCH1227의 생육에 따른 항균 활성을 측정한 결과, 생장정체기 초기에 최대 활성(300 AU/mL)을 나타내었고, 생장정체기 이후부터 활성이 점차 감소하였다. 항균물질의 활성은 pH 2-12 구간에서 비교적 안정하였으며, 열처리에 의해서도 활성이 소실되지 않아 열에 안정한 물질임을 알 수 있었다. L. salivarius LCH1227이 생산하는 항균물질은 단백질 분해효소 처리 후에 활성이 실활됨으로써 단백질성 물질인 것으로 추정되었으며, Tricine-SDS-PAGE 실험을 통하여 항균물질의 분자량은 약 5 kDa 정도임을 알 수 있었다.
발효 및 유산균 제품에 모유만을 먹은 생후 3개월된 유아의 분변으로부터 bromocresol pule을 함유한 MRS 배지에서 노란색의 집락을 형성하는 균주들을 내산성 및 담즙산 내성이 우수한 13종의 Lactobacillus 균주들을 분리하였으며 당발효성 및 생화학적 실험을 토대로 분리된 유산균들을 동정하였다. 최종적으로 선발한 균주를 L. acidophilus로 KY1909로 명명하였다. Lactic acid 생성 능력을 평가한 후 이성질체를 분석한 결과 상업적으로 이용되는 L. acidophilus NCFM, L. acidophilus CH5, L. acidophilus NOCKS 균주들은 전체 lactic acid 중에서 L(+) form이 차지하는 비율이 각각 52.49, 40.63 및 63.13%로 나타났으나, L. acidophilus KY1909는 L(+) lactic acid의 비율이 93.96%로 나타났다.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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