• 생명과학회지
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• 제16권4호
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• pp.571-578
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• 2006

Mitochondrial serine protease로 알려진 human HtrA2 (hHtrA2)는 apoptosis 유도 과정에서 중요한 역할을 담당하고 있을 뿐만 아니라 hHtrA2가 motor neuron degeneration과 관련이 있다는 최근 연구 결과가 있으나, hHtrA2의 생리적 기능은 아직 명확하게 밝혀져 있지 않다. 이와 같이 생체내에서 필수적인 업무를 담당하는 hHtrA2의 기능을 심도 있게 연구하기 위해서는 적절한 동물모델 시스템이 필요하나 이에 대한 연구도 미흡한 실정이다. 따라서 본 연구에서는 hHtrA2의 기능 분석을 위한 기본적인 실험으로 zebrafish라는 동물모델을 선택하여 hHtrA2의 발현 시스템을 정립하였다. 먼저 zebrafish에 hHtrA2를 발현시키기 위하여 zebrafish에서 일반적으로 사용되는 발현 시스템인 pCS2+ vector에 hHtrA2와 GFP를 cloning하고 plasmid를 HEK293 cell에 transfection한 후, hHtrA2-GFP fusion 단백질의 발현을 immunoblot과 immunofluorescence staining assay로 확인한 바 약 64 kDa의 hHtrA2 단백질의 발현을 확인할 수 있었다. Zebrafish에서 hHtrA2-GFP fusion 단백질의 발현양상은 immunofluorescence microscope으로 확인하였다. hHtrA2-GFP DNA와 mRNA를 zebrafish embyro에 microinjection하여 두 가지 component의 발현을 비교 분석한 결과, DNA는 dot 형태로 mRNA는 몸 전체에 퍼져보이는 형태로 발현 양상의 차이는 있었으나 둘 다 zebrafish embryo에서 잘 발현되는 것을 알 수 있다. 다음 DNA를 주 component로 microinjection하여 zebrafish embryo에서 발현을 확인한 결과 hHtrA2는 72 hpf 까지 발현이 지속되는 것을 확인하였다. 본 연구에서 정립한 hHtrA2의 zebrafish 발현 조건은 앞으로 zebrafish에서 hHtrA2의 생리적 기능을 심도있고 정확하게 연구하는 데 있어 기본적인 자료로 활용 할 수 있을 것이다.

• 한국식품과학회지
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• 제31권1호
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• pp.238-245
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• 1999

옻나무에서 극성이 큰 물과 에탄올로 추출한 물질을 생쥐 뇌세포를 배양하여 glucose oxidase에 의해 생성되는 hydroxyl radical에 대한 항산화 효과와 암세포에 미치는 영향을 알아보았다. 먼저 항산화 효과에 있어서, $7{\sim}10$일 정도 배양된 생쥐 뇌세포에 20 mU/mL GO system을 처리한 후 물 및 에탄올 추출물 (30 mg/mL)을 일정량 첨가하여 hydroxyl radical에 대한 옻나무 추출물의 항산화 효과를 측정하였다. 그 결과 GO 20 mU/mL만을 처리한 구에서는 생쥐 뇌세포의 생존률이 52.0%인데 반하여, 옻나무 물 추출물을 1, 2, 4, 7, $10\;{\mu}L$ 첨가시 각각 60.0, 66.0, 72.0, 84.0 및 90.1%로서 첨가량이 증가할수록 매우 높은 생존률을 보였다. 이러한 경향은 에탄올 추출물의 첨가시에도 유사하였는데, $1\;{\mu}L$과 $2\;{\mu}L$ 첨가시 생존률은 55.0%와 64.0% 였고, 4, 7, $10\;{\mu}L$에서는 각각 70.0, 79.0, 91.0%로서 나타났다. 항산화력을 비교하기 위하여 잘 알려진 항산화제인 ascorbic acid를 50, $100\;{\mu}M$ 첨가시 쥐의 뇌세포의 생존률은 대조군에 대해 각각 87.0%와 90.0%이었는데 이것은 각각의 옻나무 추출물 10% $(10\;{\mu}L/well)$ 첨가시 나타났던 항산화 효과와 비슷한 결과였다. 따라서 이러한 항산화 효과에 관여하는 주요 성분을 전기영동과 작용기 분석을 통해 알아본 결과 laccase라는 물질이 주성분이라는 것과 그것은 구리를 함유한 당단백질로서 크기는 약 210 KDa과 230 KDa으로서 dimer로 되어 있다는 것을 알 수 있었다. 한편 옻나무 추출물의 HeLa cell에 미치는 영향을 보기 위해 in vitro 방법으로서 HeLa cell에 대해 물 및 에탄올 추출물(30 mg/mL)을 최고 10% 농도까지 첨가하여 시간별로 측정한 결과 $10\;{\mu}L$(10%) 첨가 후 12시간에는 40.0%가, 48시간에는 60.0% 정도의 HeLa cell이 사멸되는 것을 알 수 있었다. 암세포 성장 억제 효과에 대한 결과는 in vivo 방법에 있어서도 유사한 결과를 얻었다. 즉 BALB/c의 복강에 CT-26 $(1{\times}10^6\;cells/mL)$을 접종한 후 종양을 발생케 한 후 옻나무 추출물을 주입시 주입 7일 후 대조군에 비해 종양크기가 현저하게 작아지는 것을 볼 수 있었다.

• 대한의생명과학회지
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• 제13권4호
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• pp.263-272
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• 2007

Nebulin is a giant actin binding protein (600-900 kDa) which is specific to skeletal muscle. This protein is known to regulate thin filaments length in sarcomere as a molecular template. The C-terminus of nebulin is located in the Z-disc of muscle sarcomere and is bound to other proteins such like myopalladin, titin, archvillin, and desmin. The N-terminus of nebulin binds to tropomodulin at the pointed ends of the thin filaments. In recent research, nebulin not only found in brain but also expressed in heart, stomach, and liver. So, the roles of nebulin in non-muscle tissue have been studied. However, lack of information or studies on nebulin binding proteins and nebulin function in brain are available so far. Therefore, the current study have investigated a novel binding partner of Nebulin C-terminus by using yeast two-hybrid screening with human brain cDNA library. Nebulin C-terminus, containing simple repeats, serine rich and SH3 domain, interacts with osteonectin C-terminal region. The specific interaction of nebulin and osteonectin were confirmed in vitro by using GST pull-down assay and reconfirmed in vivo by using transfected COS-7 cells with EGFP-tagged nebulin and DsRed-tagged osteonectin. Consequently, this study identified SH3 domain in nebulin C-terminus specifically binds to extracellular Ca-binding (EeC domain in osteonectin. Also, nebulin C-terminus fusion protein colocalized with osteonectin EC domain fusion protein in transfected COS-7 cells. The current study found the interaction between nebulin and osteonectin in human brain for the first time and suggested the nebulin in brain may be associated with osteonectin, as a regulator of cell cycle progression and mitosis.

• Biomolecules & Therapeutics
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• 제9권3호
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• pp.167-175
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• 2001

Recent studies have shown that cytokines are capable of modulating cardiovascular function and that some drugs used in the treatment of heart failure variably modulate the production of cytokines. Hige- namine, a positive inotropic isoquinoline alkaloid, has been used traditionally as cardiac stimulant, and reported to reduce nitric oxide (NO) and inducible nitric oxide synthase (iNOS) expression in LPS- and/or cytokine-activated cells in vitro and in vivo. Therefore, we investigated whether higenamine modulates the production of proinflammatory cytokines in myocardial infarction. In addition, effects of higenamine on antioxidant action and antioxidant enzyme expression (MnSOD) were studied. Myocardial infarction (MI) was confirmed by measuring left ventricular (LV) pressure after occlusion of the left anterior descending coronary artery (LAD) for 5 weeks in rats. Treatment of higenamine (10 mg/kg/day) reduced infarct size about 35 %, which accompanied by reduction of production TNF-$\alpha$, IL-6, but not IFN-${\gamma}$ and IL-1$\beta$ in the myocardium. The expression of TNF-$\alpha$ mRNA in infracted myocardium was significantly reduced by higenamine. Although iNOS mRNA was not detected, nitrotyrosine staining was significantly increased in myocardium of Ml compared to higenamine-treated one, Indicating that peroxynitrite-induced damage is evident in MI. Cytochrome c oxidation by peroxynitrite was concentration-dependently reduced by higenamine, an effect which was almost compatible to glutathion. Higenamine treatment did not affect the expression of MnSOD mRNA in myocardial tissues in MI. Taken together, higenamine may be beneficial in oxidative stress conditions such as ischemic-reperfusion injury and MI due to antioxidant action as well as modulation of cytokines.

• Journal of Ginseng Research
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• 제44권3호
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• pp.461-474
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• 2020

Background: Ginseng effectively reduces fatigue in both animal models and clinical trials. However, the mechanism of action is not completely understood, and its molecular targets remain largely unknown. Methods: By screening for proteins that interact with the primary components of ginseng (ginsenosides) in an affinity chromatography assay, we have identified muscle-type creatine kinase (CK-MM) as a potential target in skeletal muscle tissues. Results: Biolayer interferometry analysis showed that ginsenoside metabolites, instead of parent ginsenosides, had direct interaction with recombinant human CK-MM. Subsequently, 20(S)-protopanaxadiol (PPD), which is a ginsenoside metabolite and displayed the strongest interaction with CK-MM in the study, was selected as a representative to confirm direct binding and its biological importance. Biolayer interferometry kinetics analysis and isothermal titration calorimetry assay demonstrated that PPD specifically bound to human CK-MM. Moreover, the mutation of key amino acids predicted by molecular docking decreased the affinity between PPD and CK-MM. The direct binding activated CK-MM activity in vitro and in vivo, which increased the levels of tissue phosphocreatine and strengthened the function of the creatine kinase/phosphocreatine system in skeletal muscle, thus buffering cellular ATP, delaying exercise-induced lactate accumulation, and improving exercise performance in mice. Conclusion: Our results suggest a cellular target and an initiating molecular event by which ginseng reduces fatigue. All these findings indicate PPD as a small molecular activator of CK-MM, which can help in further developing better CK-MM activators based on the dammarane-type triterpenoid structure.

• International Journal of Stem Cells
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• 제16권2호
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• pp.215-233
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• 2023

Background and Objectives: MYC, also known as an oncogenic reprogramming factor, is a multifunctional transcription factor that maintains induced pluripotent stem cells (iPSCs). Although MYC is frequently upregulated in various cancers and is correlated with a poor prognosis, MYC is downregulated and correlated with a good prognosis in lung adenocarcinoma. MYC and two other MYC family genes, MYCN and MYCL, have similar structures and could contribute to tumorigenic conversion both in vitro and in vivo. Methods and Results: We systematically investigated whether MYC family genes act as prognostic factors in various human cancers. We first evaluated alterations in the expression of MYC family genes in various cancers using the Oncomine and The Cancer Genome Atlas (TCGA) database and their mutation and copy number alterations using the TCGA database with cBioPortal. Then, we investigated the association between the expression of MYC family genes and the prognosis of cancer patients using various prognosis databases. Multivariate analysis also confirmed that co-expression of MYC/MYCL/MYCN was significantly associated with the prognosis of lung, gastric, liver, and breast cancers. Conclusions: Taken together, our results demonstrate that the MYC family can function not only as an oncogene but also as a tumor suppressor gene in various cancers, which could be used to develop a novel approach to cancer treatment.

• 생명과학회지
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• 제32권3호
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• pp.256-262
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• 2022

옥시스테롤은 담즙산 합성 동안 일련의 효소 반응에 의해 생성된 콜레스테롤의 산화물로써, 콜레스테롤과 유사하게 세포내 영역으로 빠르게 이동하여 면역 세포 반응, 지질 대사 및 콜레스테롤 항상성과 같은 다양한 세포 과정을 조절한다. 글루코코르티코이드 수용체(GR), 에스트로겐 수용체(ER) 및 간 X 수용체(LXR)와 같은 종류의 핵 수용체는 여러 조직에서 옥시스테롤에 의해 조절될 수 있다. 가장 풍부한 옥시스테롤인 27-하이드록시콜레스테롤(27-OHC)은 조직 특이적 방식에 의해 에스트로겐 수용체 활성을 활성화하거나 억제하기 때문에 선택적 에스트로겐 수용체 조절자로 규명되었다. 특히 27-하이드록시콜레스테롤이 동맥 경화증 플라크에서 많이 발견되고 대식세포가 거품 세포로 변형되는 것을 가속화하기 때문에 동맥 경화증 발병에 기여하는 것이 분명해 보이나, 다른 연구들에서는 27-하이드록시콜레스테롤이 간 및 지방 조직을 포함한 다양한 대사 기관에 미치는 영향에 대해 반대 의견이 존재한다. 따라서 본 총설을 통해 대사 조직에서의 27-하이드록시콜레스테롤 역할에 대한 논의와 함께, 죽상 동맥 경화증 및 대사 증후군에 영향을 주는 27-하이드록시콜레스테롤의 세부 기전에 대해 논의하고자 한다.

• BMB Reports
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• 제44권7호
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• pp.490-495
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• 2011

Transcription factor AP-$2{\alpha}$ involves in the process of mammalian embryonic development and tumorigenesis. Many studies have shown that AP-$2{\alpha}$ functions in association with other interacting proteins. In a two-hybrid screening, the regulatory subunit ${\beta}$ of protein casein kinase 2 ($CK2{\beta}$) was identified as an interacting protein of AP-$2{\alpha}$; we confirmed this interaction using in-vitro GST pull-down and in-vivo co-immunoprecipitation assays; in an endogenous co-immunoprecipitation experiment, we further found the catalytic subunit ${\alpha}$ of protein casein kinase 2 ($CK2{\alpha}$) also exists in the complex. Phosphorylation analysis revealed that AP-$2{\alpha}$ was phosphorylated by CK2 kinase majorly at the site of Ser429, and such phosphorylation could be blocked by CK2 specific inhibitor 4,5,6,7-tetrabromobenzotriazole (TBB) in a dose-dependent manner. Luciferase assays demonstrated that both $CK2{\alpha}$ and $CK2{\beta}$ enhanced the transcription activity of AP-$2{\alpha}$; moreover, $CK2{\beta}$ increased the stability of AP-$2{\alpha}$. Our data suggest a novel cellular function of CK-2 as a transcriptional co-activator of AP-$2{\alpha}$.

• 한국발생생물학회지:발생과생식
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• 제4권1호
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• pp.45-52
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• 2000

Membrane-type matrix metalloproteinase(MT-MMP)는 세포막에 부착된 채로 작용하는 단백질 가수분해효소로서 최근들어 정상 및 암세포 등 각종 조직세포의 재구성에 중요한 역할을 하는 것으로 알려지고 있다. 본 연구에서는 RT-PCR 방법을 사용하여 생쥐 난자와 초기배아에서의 MT1-MMP와 MT2-MMP 유전자 발현 양상을 조사하였다. 생후 3주 및 8주된 생쥐의 난소로부터 얻은 미성숙난자와 체외 및 체내에서 성숙시킨 난자에서의 MTl-MMP와 MT2-MMP mRMA의 발현을 조사하였다. 그 결과 미성숙난자와 체외 및 체내에서 성숙시킨 난자 모두에서 MT1-MMP 및 MT2-MMP의 mRNA가 발현되었으나 미성숙난자에서는 매우 약하게 발현되는 것이 관찰되었다. 2세포기 배아, 4세포기 배아, 상실배, 포배 및 탈각한 포배를 대상으로 MT2-MMP mRNA의 발현양상을 조사한 결과 2세포기에서는 발현이 일어나지 않았고 4세포기에 이르러서야 뚜렷한 발현이 관찰되었다. 상실배와 포배에서는 현저히 강한 발현이 관찰되었다. 생쥐의 난소조직에서도 MT1-과 MT2-MMP모두 발현되는 것이 관찰되었는데 각각은 배란을 전후로 한 시기에 상관없이 항상 같은 정도의 mRNA발현을 나타내었다. 생쥐의 수란관조직도 난소조직과 유사하게 배란시기에 상관없이 같은 수준의 MT1-과 MT2-MMP mRNA 발현양상을 보여주었다. 이러한 결과들로 미루어 생쥐 배아에서 발현되는 MT2-MMP는 초기배아의 분화과정에서 중요한 역할을 할 것으로 사료된다. 난소와 수란관의 조직재구성과 관련한 MT1-과 MT2-MMP의 역할은 앞으로 더 연구되어야 할 것이다.

• IMMUNE NETWORK
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• 제24권2호
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• pp.3.1-3.23
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• 2024

Cigarette smoke extract (CSE)-treated mouse airway epithelial cells (MAECs)-derived exosomes accelerate the progression of chronic obstructive pulmonary disease (COPD) by upregulating triggering receptor expressed on myeloid cells 1 (TREM-1); however, the specific mechanism remains unclear. We aimed to explore the potential mechanisms of CSE-treated MAECs-derived exosomes on M1 macrophage polarization and pyroptosis in COPD. In vitro, exosomes were extracted from CSE-treated MAECs, followed by co-culture with macrophages. In vivo, mice exposed to cigarette smoke (CS) to induce COPD, followed by injection or/and intranasal instillation with oe-TREM-1 lentivirus. Lung function and pathological changes were evaluated. CD68⁺ cell number and the levels of iNOS, TNF-α, IL-1β (M1 macrophage marker), and pyroptosis-related proteins (NOD-like receptor family pyrin domain containing 3, apoptosis-associated speck-like protein containing a caspase-1 recruitment domain, caspase-1, cleaved-caspase-1, gasdermin D [GSDMD], and GSDMD-N) were examined. The expression of maternally expressed gene 3 (MEG3), spleen focus forming virus proviral integration oncogene (SPI1), methyltransferase 3 (METTL3), and TREM-1 was detected and the binding relationships among them were verified. MEG3 increased N6-methyladenosine methylation of TREM-1 by recruiting SPI1 to activate METTL3. Overexpression of TREM-1 or METTL3 negated the alleviative effects of MEG3 inhibition on M1 polarization and pyroptosis. In mice exposed to CS, EXO^-CSE further aggravated lung injury, M1 polarization, and pyroptosis, which were reversed by MEG3 inhibition. TREM-1 overexpression negated the palliative effects of MEG3 inhibition on COPD mouse lung injury. Collectively, CSE-treated MAECs-derived exosomal long non-coding RNA MEG3 may expedite M1 macrophage polarization and pyroptosis in COPD via the SPI1/METTL3/TREM-1 axis.